蛋白質組學與心血管疾病

摘要：心血管疾病是目前威脅人類健康和生命的主要病因，其中許多心臟疾病的細胞和分子機制的研究手段相對比較匱乏，而隨著人類基因組圖譜的繪制完成和蛋白質組學的不斷完善，因此，蛋白質組作為基因表達的最終產(chǎn)物，將為揭示疾病發(fā)生、發(fā)展的轉化規(guī)律提供有益的思路。本文綜述了近年來蛋白質組學應用于心血管疾病的研究進展。

關鍵詞：蛋白質組學；心血管疾病

2000年6月26日，由六國合作研究的人類基因組工作草圖基本完成，已給制出人體97%的基因組，基中85%的基因組序列得到了精確測定，包含了人體約30億個堿基對的正確排序。此后，科技工作者們開始將目光轉向蛋白質組學（proteomics）、功能基因組學的研究，研究的重心也從簡單地揭示遺傳信息轉移到外界因素下的生物功能研究，蛋白質組學也由此應運而生。

1 蛋白質組學的定義

蛋白質組（ Proteome）的概念，最早見諸于1995年7月的\"Electrophoresis\"雜志上，它是指一個有機體的全部蛋白質組成及其活動方式。早期定義為：微生物基因組表達的整套蛋白質，在多細胞微生物中，整套蛋白質指一種組織或細胞表達的蛋白質，后來定義為：一個基因組所表達的蛋白質。

蛋白質組學（Proteomics）是以蛋白質組為研究對象的新的研究領域。它可分為：①表達蛋白質組學（expression proteomics： 即把細胞、組織中的蛋白，建立蛋白定量表達圖譜，或掃描EST圖。該方法依賴2-D凝膠圖和圖像分析技術，而且在整個蛋白質組水平上提供了研究細胞通路，以及疾病、藥物相互作用和一些生物刺激引起的功能紊亂的可能性；②細胞圖譜蛋白質組學（cell-map proteomics）：即確定蛋白質在亞細胞結構中的位置；通過純化細胞器或用質譜儀鑒定蛋白復合物組成等，來確定蛋白質-蛋白質的相互作用。

2 蛋白質組學在心血管疾病中的應用

心血管疾病嚴重威脅人類的健康，其發(fā)生和發(fā)展涉及動態(tài)、復雜、精細的細胞內過程。作為細胞的基本功能單位，蛋白質是生命活動的執(zhí)行者，廣泛參與細胞的功能與調節(jié)，在病理條件下發(fā)生改變，決定細胞、組織和器官的表型[1]。基因表達產(chǎn)物--蛋白質異常是疾病發(fā)生發(fā)展中的重要因素。目前，蛋白質組學技術已經(jīng)廣泛應用于腫瘤、血液性疾病、自身免疫病等方面的研究，并且取得了一定進展。

2.1蛋白質組學在冠狀動脈粥樣硬化中的研究應用 冠狀動脈粥樣硬化樣心臟病（coronary heart disease，CHD，簡稱冠心病）是一種遺傳和環(huán)境危險因素共同作用而發(fā)病的多基因遺傳性疾病。CHD的發(fā)生主要涉及脂質代謝障礙、血管內皮細胞損傷、單核細胞遷移并分化為巨噬細胞、平滑肌細胞從中膜遷移至內膜并增殖、泡沫細胞的形成、細胞壞死和脂質沉積等許多過程。You SA等[2]將蛋白質組的方法運用于尋找冠狀動脈粥樣硬化發(fā)病的生物標志物的研究。他們發(fā)現(xiàn)，冠狀動脈病患者的鐵蛋白輕鏈的表達量顯著增加。隨后的DNA印跡和PCR進一步證實了鐵蛋白輕鏈表達水平的升高，并推測增加的鐵蛋白輕鏈通過氧自由基的產(chǎn)生調節(jié)血管壁內脂類的氧化狀態(tài)，加速冠狀動脈病的產(chǎn)生。Buscemi等[3]叫利用二維凝膠電泳技術分離蛋白質，利用分行質譜技術（MALDI-TOF）鑒定Rac1轉基因心肌肥厚小鼠模型中肌酸激酶M·鏈蛋白的變化，結果顯示，該種蛋白含量比正常組高，因此，監(jiān)測肌酸激酶M.鏈蛋白的變化可以用來診斷心肌肥厚，并判斷病情的變化。楊鵬遠等[4]分離大鼠冠狀動脈總蛋白，檢測出2626個蛋白質斑點，并且得到不同條件下的蛋白質組的差異圖譜，對比分析了正常組和動脈粥樣硬化模型組心肌組織的差異蛋白，發(fā)現(xiàn)33個蛋白質斑點只在正常大鼠心肌蛋白檢測到表達，46個蛋白點在兩種細胞中表達量上有顯著差異。

2.2蛋白質組學在擴張型心肌病中的研究應用 擴張型心肌病 （dilated cardiomyopathy，DCM）是心肌疾病的一種類型，其特征為左或右心室或雙側心室擴大，并伴有心肌肥厚。心室收縮功能減退，伴或不伴充血性心力衰竭。室性或房性心律失常多見。病情呈進行性加重，死亡可發(fā)生于疾病的任何階段迄今為止，病因未明，DCM是利用蛋白質組學研究最為深入的一類心血管疾病。研究發(fā)現(xiàn)有100多種心肌蛋白質在DCM的心肌細胞中明顯減少，這些蛋白質許多已經(jīng)被鑒定，其中包括細胞骨架蛋白即肌纖維蛋白，與線粒體及能量產(chǎn)生相關蛋白，與應激反應相關蛋白等[5]。Pleissner等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，DCM患者的52種右心房心肌蛋白的表達水平與正常人相比發(fā)生了明顯變人，其中肌球蛋白輕鏈2（Mt，C-2）的蛋白豐度增加到336%，而HSP27降低到59%，這兩種蛋白被認為是DCM的右心房的特征性標記蛋白。Weekes等[7]對牛先天性DCM 心肌進行2-DE分析。證實其存在線粒體相關蛋白表達的改變，共35個相關蛋白質點，24種蛋白質表達下降，11種蛋白質豐度增高， 降低的蛋白質包括線粒體和能量代謝表達的蛋白，包括：肌酸激酶M、細胞色素C氧化酶、細胞色素b5、肌紅蛋白、3，2-transenoyl-CoA轉移酶。

2.3蛋白質組學在心力衰竭中的研究應用 心力衰竭的臨床表現(xiàn)有左心室泵血功能降低、射血分數(shù)下降、心臟擴大、神經(jīng)體液反應活化，在細胞水平出現(xiàn)心肌細胞形態(tài)和收縮功能的變化。應用雙向電泳技術研究其蛋白質組變化，有助于了解心衰時心肌細胞功能障礙及代償作用的分子機制。Heinke等[8]以右室起搏（245 bpm，34w）誘發(fā)犬心力衰竭，取左心室肌組織進行二向電泳和MALDI-MS質譜分析，發(fā)現(xiàn)在pH 3～10的范圍內分離的蛋白質分子量為10～150 kDa，有31種蛋白質發(fā)生明顯變化，其中21種數(shù)量減少，10種增加。發(fā)生變化的蛋白質相對分子量在15～68 kDa之間，等電點為4.6～9.02，有60%的蛋白質等電點大于6.5，目前已鑒定出其中的23種包括：線粒體應激70相關蛋白（屬熱休克蛋白HPS70家族）數(shù)量增加，肌酸激酶M鏈、羥甲基戊二酰輔酶A合成酶、3，2-transenoyl-CoA轉位酶、細胞色素C氧化酶、細胞色素b5數(shù)量減少；磷酸甘油酸變位酶、磷酸丙糖異構酶增加，血紅蛋白、肌紅蛋白均減少，半胱氨酸蛋白酶抑制劑cystationC減少，Ras相關蛋白增加。以上變化普遍存在于不同種屬生物的心衰過程中。

2.4蛋白質組學在心肌缺血/再灌注損傷中的研究應用 心肌缺血/再灌注損傷（ischemia/reperfusion iniury，I/R）包括從輕微缺血時的可逆性損傷到嚴重缺血時不可逆性細胞壞死。研究該過程中蛋白質組的變化，是理解這一病理過程的基礎。目前研究重點主要集中于細胞骨架、肌原纖維、信號轉導分子等蛋白組分的改變。Coma等[9]采用免疫組化和Western Blotting方法研究成年豚鼠在常氧、缺血、缺血/再灌注、鈣反常等情況下細胞內鈣超載對心肌細胞內肌鈣蛋白T（TnT）免疫反應性修飾的影響：正常與單純缺血組呈陰性反應，缺血再灌注和鈣反常心肌細胞呈TnT免疫反應陽性。Western Blotting顯示，缺血再灌注和鈣反常心肌細胞中TnT出現(xiàn)240～260 kDa、65～66 kDa的反應性多肽片段。Arrell等[10]采用腺苷（100/Zmol/L）預處理成年兔心肌細胞，經(jīng)分步提取蛋白、雙向電泳分離后發(fā)現(xiàn)，在生理pH條件下提取低豐度胞漿蛋白時可見約800個斑點，有3個條帶遷移。酸性條件下提取高豐度肌絲蛋白，銀染后可見蛋白多集中于pH 5.0左右。Westem Bloting顯示該組蛋白質為磷酸化MLC1（myosin light chain 1），其中腺苷預處理組MLC1中有（34.04～2.7）%發(fā)生單磷酸化，（25.74～1.6）%發(fā)生雙磷酸化，其磷酸化程度高于對照組[（28.94～2.4）%與（5.14～1.0）%，P<0.05，且以單磷酸化形式增多為主。以MALDI（matrix-assisted laser desorption ionization）-TOF（time offlight）鑒定磷酸化的氨基酸殘基發(fā)現(xiàn)，質量為558.667 Da和790.845 Da的片段出現(xiàn)在未磷酸化的MI.E1圖譜中，而在磷酸化樣本中明顯缺失。

2.5蛋白質組學在心肌細胞線粒體功能中的研究應用 由于心臟做功需要提供足夠的能量，心肌細胞內富含大量的線粒體，當線粒體出現(xiàn)病變時，心臟功能會受到影響。Taylor等 用高度純化的正常人心臟組織的線粒體編輯了線粒體蛋白質組目錄。通過雙相電泳共產(chǎn)生了615個清晰的蛋白點，將所有蛋白質都標出了pI值、分子量范圍和疏水性等特征參數(shù)。線粒體膜內的已知氧化磷酸化的蛋白質亞組的覆蓋率>90%。不過，其中19%的被鑒定蛋白質的生物化學信息尚未明確。肌酸激酶（CK）對于維持高能磷酸鹽內環(huán)境穩(wěn)定至關重要。對CK基因雙敲除（DbKO-CK）而缺失MM（muscle mitochondria1）和ScMit（sarcomeric mitochondriM）CK亞型小鼠研究表明，骨骼肌收縮功能嚴重受損，而心肌功能基本未發(fā)生顯著變化。通過蛋白質組技術研究發(fā)現(xiàn)，MM-和ScMit-CK亞型的缺失并未引起心肌線粒體蛋白質很大程度的變化 。

總之，蛋白質組學是對全套基因組所編碼的蛋白質的組成、結構和功能，以及蛋白質之間的相互作用進行整體研究的一門新興學科。對蛋白質組進行研究的最終目的在于：找到具體的分子靶點，并以此為突破口，最終攻克如心血管疾病這樣的人類重大疾病。通過功能蛋白質組學的研究，可能揭示蛋白質修飾究竟是某一疾病的起因還是結果，從而達到診斷和治療疾病的目的，為我們下一步的醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)作出貢獻。

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編輯/哈濤