微小RNA—146a在大黃素對脂多糖誘導的肺泡巨噬細胞炎癥反應中的作用

摘要：目的 探討微小RNA-146a（miR-146a）在大黃素對脂多糖（LPS）誘導的肺泡巨噬細胞炎癥反應中的作用。方法 將體外去致熱源培養的大鼠肺泡巨噬細胞株NR8383分為空白對照組、LPS處理組和大黃素+LPS處理組，細胞培養6 h后收集細胞，采用實時熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-qPCR）檢測細胞中miR-146a的表達，Western blot法檢測細胞中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-6（IL-6）的表達。結果 與空白對照組相比較，LPS作用后細胞中miR-146a、TNF-α和IL-6表達量明顯升高；與LPS處理組相比較，大黃素+LPS處理組中miR-146a表達量顯著上調，而TNF-α和IL-6表達量顯著下調。結論 大黃素可上調肺泡巨噬細胞中miR-146a的表達，大黃素可抑制巨噬細胞中TNF-α和IL-6的表達，miR-146a可能參與調控大黃素抗肺泡巨噬細胞炎癥反應過程。

關鍵詞：大黃素；miR-146a；肺泡巨噬細胞；炎癥反應

微小RNA（microRNA， miRNAs）是一類長度約21～25個核苷酸的內源性非編碼小分子RNA，miRNA由基因組轉錄，在轉錄后水平調控基因表達。研究表明，miRNAs參與炎癥反應、細胞增殖與凋亡、組織分化和腫瘤形成等生理過程的調節[1]。其中miRNA-146a是當前研究熱點之一，miRNA-146a在Toll樣受體/核轉錄因子（NF-κB）炎癥通路中具有重要的負反饋調節作用，從而抑制炎癥反應[2]，另外在LPS誘導肺泡巨噬細胞產生炎癥反應中，miRNA-146a的表達與炎癥因子表達呈負相關[3]，表明miRNA-146a可能作為抑制肺泡巨噬細胞炎癥反應的新作用靶點。近年來研究表明大黃素對急性胰腺炎誘導的腹腔巨噬細胞炎癥反應有一定抑制作用[4]，但在LPS誘導的肺泡巨噬細胞炎癥反應中，miRNA-146a是否在大黃素抑制炎癥反應過程中發揮了一定作用尚未見報道，為此，本研究擬探討miRNA-146a在大黃素對LPS誘導的肺泡巨噬細胞炎癥反應中的作用。

1資料與方法

1.1一般資料 胎牛血清、Ham's F-12K培養基和0.25%EDTA胰蛋白酶購自美國Gibco公司；細胞漿蛋白抽提試劑盒和BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所；大黃素（純度>98%）購自美國Sigma公司，大黃素用二甲基亞砜配制成0.2 mmol/L的貯存液，-20℃冰箱保存（二甲基亞砜的終濃度小于0.1%，該濃度對細胞無明顯影響）；脂多糖（LPS）購自美國RD公司；TNF-α、IL-6和β-actin抗體購自美國Epitomics公司；Trizol和逆轉錄實時定量聚合酶鏈反應（PCR）引物購自美國Invitrogen公司；Prime Script逆轉錄試劑盒購自美國ABI公司。

1.2方法 大鼠肺泡巨噬細胞株NR8383購自中科院上海細胞庫，培養在含l5%胎牛血清、質量濃度1×105 U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素、2 mmol/L谷氨酰胺和1.5 g/L碳酸氫鈉的Ham' s F-12K培養液中，置于37℃、5%的CO2的培養箱內培養，2～3 d換液1次，細胞單層貼壁生長至70%～80%融合時胰蛋白酶消化傳代。

1.3實驗模型制備及分組 將處于對數生長期的NR8383細胞按1×106/孔接種于6孔板，實驗分四組，每組5個復孔。①LPS處理組：在培養基中加入濃度為1 mg/L的LPS；②空白對照組：每孔加入等體積的PBS；③大黃素+LPS處理組：在培養基中加入濃度為5 mg/L的大黃素作用30 mins后，再加入濃度為1 mg/L的LPS。細胞放入培養箱6 h后離心收集細胞，置于-80℃冰箱。

1.4 Western blot檢測NR8383細胞中TNF-α和IL-6的表達 裂解細胞并分離細胞蛋白質，用Bradford法測量蛋白濃度后取等量蛋白質樣品（20 μg/孔），常規8% SDS-PAGE電泳，半干轉膜儀轉膜，5%脫脂奶粉封閉，加入特異性一抗（1∶1000）于4℃下孵育過夜，HRP標記的羊抗兔IgG為第二抗體（1∶2500）室溫孵育1 h，ECL顯色，條帶暴光強度用Quantity One 4.6.2（BIO，RAD）軟件分析，以β-actin為內參，通過與內參的灰度比，得出目的條帶的相對表達水平。

1.5 RT-qPCR檢測NR8383細胞中miRNA-146a的表達 用Trizol試劑提取總RNA，按說明書操作。總RNA經紫外分光光度計測定260 nm與280 nm處光密度比值（D260/D280）為1.9～2.1，瓊脂糖凝膠電泳法檢測總RNA純度。采用PrimeScript逆轉錄試劑盒進行逆轉錄，采用SYBR實時熒光定量試劑盒進行實時定量PCR檢測，反應在25 μl體系中進行，反應條件：50 ℃下30 min逆轉錄，94 ℃變性1 min，57℃退火1 min，72℃延伸7 min。以U6 snRNA作為內參，miR-146a的相對表達量采用2-△△Ct計算。

1.6統計學處理 采用SPSS 11.5軟件包進行統計學處理，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，正態分布變量多組間比較用方差分析，兩組間比較用t檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2結果

2.1 TNF-α和IL-6在NR8383細胞中的表達變化 Western blot檢測結果表明，與空白對照組相比較，LPS作用后NR8383細胞中TNF-α和IL-6的表達明顯上調，差異有統計學意義（P<0.05）；TNF-α和IL-6在大黃素+LPS處理組中的表達較LPS處理組顯著下降，有顯著性差異（P<0.05），見圖1。

圖1 Western blotting檢測TNF-α和IL-6在NR8383細胞中的表達，

以β-actin為內參

2.2 miR-146a在NR8383細胞中的表達變化 LPS作用6 h后NR8383細胞中miR-146a的相對表達量為（5.19±1.26），與對照組（1.04±0.28）相比較，差異有統計學意義（P<0.05）；大黃素+LPS處理組中miR-146a的表達量為（12.84±2.08），與LPS處理組相比較，有顯著性差異（P<0.05）。

3討論

急性肺損傷是由多種炎性介質及效應細胞導致肺通透性增加的急性、進行性、缺氧性呼吸衰竭，是膿毒癥中最常受累的器官之一。而肺損傷時肺泡巨噬細胞被激活，不但可吞噬侵入肺臟的炎癥粒子，參與肺臟的防御和免疫，而且還能分泌大量的生物活性物質參與中性粒細胞在肺內的遷徙過程，因此在急性肺損傷過程中發揮了關鍵作用[5]。LPS是革蘭氏陰性桿菌細胞壁的主要致病成分，也是膿毒癥主要致病因素，在膿毒血癥過程中，LPS可活化肺泡巨噬細胞Toll樣受體/核轉錄因子（NF-κB）炎癥通路，導致大量炎癥因子如TNF-α、TGF-β、IL-6和IL-1釋放，最終引起急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）的發生[6-7]。TNF-α作為是炎癥反應過程中出現最早和最重要的炎性介質，能激活中性粒細胞和淋巴細胞，使血管內皮細胞通透性增加，調節其他組織代謝活性并促使其他細胞因子的合成和釋放，而IL-6能誘導B細胞分化和產生抗體，并誘導T細胞活化增殖、分化，參與機體的免疫應答，是炎性反應的促發劑[8]。在本研究采用LPS刺激肺泡巨噬細胞株NR8383來建立炎癥反應模型，并檢測TNF-α和IL-6在巨噬細胞中的表達來判斷模型是否建立成功和炎癥反應程度。本研究結果表明，LPS作用NR8383細胞后，TNF-α和IL-6蛋白表達顯著上調，從而成功建立起炎癥反應模型，與劉[9]的研究結果相似。

大黃素（Emodin，6-甲基-1，3，8-三羥基蒽醌）是一種蒽醌類物質，是從大黃屬、蓼屬、鼠李屬和番瀉葉中分離出來的主要有效單體，千百年來被廣泛應用于傳統中醫藥。近年來研究表明大黃素擁有多種生物學功能，如抗菌、抗炎和免疫抑制[10]等。同時有研究表明大黃素對急性胰腺炎誘導的肺損傷有一定保護作用[3]。在本研究觀察到，大黃素預處理肺泡巨噬細胞株NR8383后可顯著下調LPS誘導的TNF-α和IL-6的產生，從而首次表明大黃素對肺泡巨噬細胞誘導的炎癥反應有一定抑制作用。

微小RNA（microRNAs， miRNAs）是一類非編碼小分子RNA，miRNAs可通過特異性識別靶基因mRNA的3'端非編碼區位點而抑制蛋白翻譯或誘導mRNA的降解，從而在轉錄后水平調控基因表達[11]。近年來研究表明miRNAs在機體炎癥反應過程中發揮了一定作用，而miR-146a是當前研究的熱點之一，miRNA-146a可作用于Toll樣受體/NF-κB炎癥通路中的編碼基因IRAK-1和TRAF-6，對Toll樣受體/NF-κB通路具有重要的負反饋調節作用，從而抑制炎癥反應[2，12]。劉芬[13]等觀察到肺泡巨噬細胞轉染miR-146a后可下調肺泡巨噬細胞中TNF-α的表達，從而表明miR-146a與肺泡巨噬細胞介導的炎癥反應關系密切。在本研究中，筆者觀察到LPS刺激肺泡巨噬細胞株NR8383后，miR-146a的表達增加，與文獻報道相符；另外大黃素預處理NR8383細胞后可進一步上調miR-146a在細胞中的表達，同時大黃素可抑制肺泡巨噬細胞中炎癥因子的表達，可以推測miR-146a在大黃素抑制肺泡巨噬細胞炎癥反應中發揮了一定作用。

綜上所述，本研究成功建立起LPS誘導產生的肺泡巨噬細胞炎癥反應模型，大黃素作用巨噬細胞后可抑制炎癥因子TNF-α和IL-6的表達，并誘導miR-146a在細胞中的表達，表明大黃素發揮抗炎作用的機制之一可能是通過抑制巨噬細胞中miR-146a的表達來實現。

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編輯/肖慧