關于探討HBV DNA測定的影響因素

乙型肝炎病毒核酸（HBVDNA）的定量測定在乙型肝炎患者臨床用藥，治療監測及判斷預后具有重要意義。目前，HBV DNA測定方法主要用于熒光定量聚合酶鏈反應（FQ-PCR），該方法具有操作簡單，定量范圍寬，結果重復性好等優點。但因其敏感高，衛生部臨檢中心對方法中各個環節制定了規范性的要求，以消除除PCR本身外的外界影響因素。

1資料與方法

1.1試劑和儀器HBV DNA熒光定量PCR試劑盒及DN7600熒光定量PCR擴增儀均由廣州中山大學達安基因公司提供。

1.2實驗標本的選擇均為臨床確診乙肝患者血清，HBV DNA的拷貝數104～108/ml。每份標本總膽紅素、血脂均在正常范圍內無溶血。

1.3溶血標本的制備將陽性血液離心后先取300ul作對照血清，然后將剩余血標本用無菌竹簽攪拌，然后置-20℃冷凍10min，37℃水浴溶解后，4000 r/mon離心5mon，取400ul上清液備用；然后以上法繼續對原標本進行攪拌、離心、冷凍。

1.4黃疸標本的制備取3種濃度不同的膽紅素血清各180ml，與實驗組20ul血清混合，其中每份吸取100ul用于HBV DNA定量測定，剩余100ul用于總膽紅素測定。對照組用實驗組血清20ul加入正常血清180ul，取100ul進行HBV DNA測定。

1.5脂血標本的制備將不同濃度脂血血清和正常血清加入到實驗組和對照組，同時測定HBV DNA含量，實驗組測定TG（甘油三酯）的含量。

1.6正常血清制備收集體檢健康者血清，無黃疸、溶血和脂血。

以上黃疸、脂血、正常血清標本均經過HBV DNA檢測，連續2次均為陽性。血紅蛋白測定用邁瑞BC-5600血液分析儀測定，總膽紅素含量用釩酸鹽法，甘油三酯（TG）測定用酶法，其均在日立AU-2700全自動生化分析儀上進行檢測。

1.7 HBV DNA測定取待測血清100 ul，加DNA濃縮液100 ul，12000 r/min離心10min后，棄掉上清液取沉淀，加20 ul DNA提取液后放入干式恒溫器內100℃ 10 min，冷卻后12000 r/min離心5 min，取上清液2 ul進行PCR擴增。每份標本測定3次，取3次結果均值作為測定值。

1.8統計學處理 將測定值換算成對數值，進行配對資料t檢驗。

2結果

2.1溶血標本對HBV DNA測定的影響我們用Hb含量（g/L）表示溶血程度，通過對未溶血血清與不同溶血程度血清HBV DNA測定，將拷貝數換算成對數值，進行配對資料t檢驗（t值為1.231），結果無顯著性差異（P>0.05）。

2.2膽紅素對HBV DNA測定影響用T-BiL含量（umol/L）表示黃疸程度，正常血清T-BiL含量為2～20 umol/L。通過對正常血清與不同濃度總膽紅素血清的HBV DNA測定，其拷貝數換算成對數值，進行配對資料t檢驗（t值為0.834），結果無顯著性差異（P>0.05）。

2.3血脂對HBV DNA測定影響脂血血清我們只討論TG（血清甘油三酯）標本，用TG含量（mmol/L）表示，正常血清TG含量為0.34～1.71 mmol/L。

通過對正常血清TG與不同濃度TG血清的HBV DNA測定，其拷貝數經換算成對數值，進行配對資料t檢驗（t值為0.05），結果無顯著差異（P>0.05），見表1。

3討論

影響PCR準確性因素很多，除PCP本身因素及反應體系外，標本本身也可能對HBV DNA檢測結果產生影響，最常見情況有溶血、脂血和黃疸。實驗表明，在Hb≤149 g/L，T-BiL≤145.3 umol/L，TG≤20.71 mmol/L范圍范圍內，高、中、低不同病毒載量標本的HBVDNA定量結果，均不受Hb、TG、T-BiL影響（P>0.05）。

本實驗中，對各種溶血不同程度HBV DNA陽性標本進行檢測，其中結果與未溶血的標本無顯著性差異。原因可能是在提取核酸前，已先用濃縮液經高速離心沉淀，HBV病毒顆粒并棄去上清，大大減少了干擾物質同時也減少了Hb的含量。還有一個原因是Hb經100℃10 min后，卟啉環已經被破壞，經過離心沉淀后，待測上清液中僅存其衍生物了。在脂血（這里主要討論TG）檢測中，HBV DNA熒光定量干擾機制主要是血液中低密度脂（乳糜微粒等）對熒光屏蔽和吸收作用。在實驗中TG為20.71 mmol/L時，對檢測結果也沒有產生影響。原因可能是脂血中TG密度低，血清標本在冷凍或冷藏保存后，經高速冷凍離心，容易飄浮在上層，加之處理標本中多次稀釋，干擾作用就變得很小。膽紅素對實驗的干擾主要在其本身的光吸收作用，但通過對不同濃度膽紅素標本的HBV DNA測定，并未發現有明顯干擾現象，原因可能也與標本處理中膽紅素丟失和多次稀釋有關。

本實驗3種影響因素比較，雖然在統計學上無顯著差異，但對每一位患者的檢測結果越接近真值越好，所以我們建議最好盡量用無嚴重溶血、黃疸、血脂的標本[1-3]。

參考文獻：

[1]郭華國，姚正國.脂血、血紅蛋白、膽紅素標本對乙肝病毒DNA熒光定量測定影響[J].微循環雜志，2006，16（1）：32-33.

[2]郭華國，桂瑞豐.高血脂、肝素對乙型肝炎病毒DNA熒光定量PCR測定干擾機制的探討[J].現代檢驗醫學雜志，2007，22（1）：58-60.

[3]高峰，高慧華，揚學文.脂血因素對熒光定量PCR檢測乙肝病毒DNA的影響及解決措施[J].臨床檢驗雜志，2007，25（5）：359-360.

編輯/肖慧