羅氏Cobas e601檢測(cè)人附睪蛋白4（HE4）殘留試劑的性能評(píng)價(jià)

摘要：目的 評(píng)價(jià)羅氏Cobas e601全自動(dòng)免疫分析儀檢測(cè)人附睪蛋白4殘留試劑的分析性能，探討回收再利用的可行性。方法 參考美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）系列文件和相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)血清人附睪蛋白4（HE4）回收試劑的精密度、準(zhǔn)確度、分析測(cè)量范圍、生物參考區(qū)間進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果 羅氏Cobas e601檢測(cè)HE4殘留試劑批內(nèi)、批間精密度符合廠商聲明；準(zhǔn)確度結(jié)果相對(duì)偏差為0～0.72%；分析測(cè)量范圍在35.08～1416.50可接受；生物參考區(qū)間適用。結(jié)論 羅氏Cobas e601電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)使用同批號(hào)HE4回收試劑的主要分析性能符合要求，一定時(shí)限內(nèi)可回收利用。

關(guān)鍵詞：殘留試劑；電化學(xué)發(fā)光；人附睪蛋白4

羅氏Cobas e601全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，具有高靈敏度、高特異性、高親和力、高準(zhǔn)確度、線性范圍寬、自動(dòng)化程度高、無放射性污染、操作簡(jiǎn)便快速、試劑保存期長(zhǎng)、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，是目前最先進(jìn)的標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)，具有廣闊的應(yīng)用前景[1]。試劑為原裝進(jìn)口，成本較高，每瓶試劑條碼記錄為100人份。經(jīng)日常統(tǒng)計(jì)，當(dāng)完成100人次檢測(cè)后，試劑盒約有15%～25%的殘留試劑，若有效回收利用，可明顯降低試劑成本。本研究以腫瘤標(biāo)志物HE4著手，在保證標(biāo)本檢驗(yàn)質(zhì)量的前提下，探討腫瘤標(biāo)記物殘留試劑回收利用的可能性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本院2013年6月門診體檢者新鮮血清（樣本無溶血、無黃疸、無脂血），混合后分裝﹣20°C冷凍保存。

1.2 儀器與試劑 德國(guó)Roche公司Cobas 6000全自動(dòng)生化免疫分析模組中e601全自動(dòng)免疫檢測(cè)模塊。標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品Roche原裝配套。檢測(cè)試劑為同批次有效期內(nèi)、開啟10d內(nèi)的原裝殘留試劑拼裝混合而成，3～4盒殘留試劑可拼裝一盒。方法是將三聯(lián)瓶中M瓶：鏈霉親和素包被的順磁性微粒（白蓋）、R1：生物素化的抗HE4單克隆抗體（灰蓋）和R2：非同位金屬三聯(lián)吡啶釕+標(biāo)記的抗HE4單克隆抗體（黑蓋）充分混勻后分別集中于一個(gè)試劑盒的3個(gè)對(duì)應(yīng)瓶中，組成一盒拼裝試劑。使用前置4℃冰箱冷藏，消泡后裝載上機(jī)，可避免試劑屏蔽。

1.3 方法 按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序?qū)x器進(jìn)行常規(guī)保養(yǎng)和維護(hù)，拼裝試劑上機(jī)使用時(shí)須做通用腫瘤標(biāo)志物質(zhì)控（2個(gè)濃度水平），確保質(zhì)控在控后進(jìn)行標(biāo)本檢測(cè)。

1.3.1 精密度驗(yàn)證 批內(nèi)精密度試驗(yàn)：①參考美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)組織（CLSI）EP5-A2]，選取2個(gè)水平的質(zhì)控血清（TM1、TM2）作為批內(nèi)和批間精密度的待測(cè)標(biāo)本，用原裝試劑和拼裝試劑分別連續(xù)重復(fù)檢測(cè)20次。計(jì)算平均值、SD和CV；②批間精密度試驗(yàn)：選擇TM1、TM2 2個(gè)濃度的質(zhì)控品，測(cè)定1次/d，用原裝試劑和拼裝試劑分別連續(xù)測(cè)定20d，計(jì)算平均值、SD和CV。通過實(shí)驗(yàn)得到估計(jì)的批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差（S批內(nèi)）和批間標(biāo)準(zhǔn)差（S批間）。并與廠家聲明的不精密度進(jìn)行比較。根據(jù)CLIA'88要求，批內(nèi)精密度應(yīng)≤1/4TEa，批間精密度應(yīng)≤1/3TEa。

1.3.2 準(zhǔn)確度驗(yàn)證驗(yàn)證 參考CLSI EP5-A2文件，先用HE4校準(zhǔn)品（Lot：168118濃度分別為：4.1pmol/L、196.0pmol/L）對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行校準(zhǔn)；再用校準(zhǔn)品對(duì)原裝試劑和拼裝試劑分別進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)各自檢測(cè)結(jié)果與靶值進(jìn)行比對(duì)，計(jì)算檢測(cè)值與靶值的相對(duì)偏倚，計(jì)算公式：Bias=（測(cè)定值-靶值）/×靶值%

1.3.3分析測(cè)量范圍驗(yàn)證 參考CLSI EP6-A3文件，分別收集HE4濃度接近廠商聲明的線性范圍下限和上限的低值樣本（L）和高值樣本（H），按L、0.75L+0.25H、0.5L+0.5H、0.25L+0.75H、H混合，配制成系列濃度實(shí)驗(yàn)樣本，用拼裝試劑對(duì)每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)量2次。在重復(fù)測(cè)量誤差符合實(shí)驗(yàn)要求的條件下，數(shù)據(jù)在SPSS13.0軟件上進(jìn)行多項(xiàng)式回歸分析，判斷實(shí)驗(yàn)所涉及的濃度范圍內(nèi)是否為線性。當(dāng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為非線性時(shí)，計(jì)算線性偏離。若每個(gè)濃度點(diǎn)的線性偏離小于線性允許誤差，則實(shí)驗(yàn)所涉及的濃度范圍即為線性范圍。本研究設(shè)定重復(fù)誤差≤5%，線性偏差≤10%為可接受的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.4 生物參考區(qū)間驗(yàn)證 采集在本院體檢者（血液生化、心電圖和B超檢測(cè)均正常）空腹血清，用拼裝試劑按標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行樣本檢測(cè)，要求20個(gè)檢測(cè)數(shù)據(jù)只允許10%數(shù)據(jù)在給定的生物參考區(qū)間之外，否則需要進(jìn)行檢測(cè)項(xiàng)目的生物參考區(qū)間建立。

2 結(jié)果

2.1 精密度驗(yàn)證結(jié)果 原裝試劑和拼裝試劑檢測(cè)Roche 2個(gè)水平的質(zhì)控血清（TM1、TM2），批內(nèi)精密度與批間精密度檢測(cè)結(jié)果均符合Roche公司聲明。實(shí)測(cè)CV均<5%（見表1、2）。

2.2 準(zhǔn)確度驗(yàn)證結(jié)果 與標(biāo)準(zhǔn)品比較，原裝試劑實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)偏差（SE%）為0～0.61%，SE%≤1/2CLIA'88允許總誤差（TEa）為可接受。拼裝試劑檢測(cè)結(jié)果相對(duì)偏差為0～0.72%，也在允許范圍之內(nèi)（見表3）。

2.3 分析測(cè)量范圍驗(yàn)證結(jié)果 對(duì)系列濃度樣本檢測(cè)結(jié)果和預(yù)期值進(jìn)行多項(xiàng)式回歸統(tǒng)計(jì)，預(yù)期值為X，實(shí)測(cè)值為Y，得直線方程Y=bX+a，即Y=1.0085+22.836，相關(guān)系數(shù)為0.9995，>0.975，線性理想。實(shí)測(cè)線性范圍35.08pmol/L～1416.50 pmol/L；試劑盒線性范圍15pmol/L～1500 pmol/L，符合廠商聲明（見表4）。

2.4 生物參考區(qū)間驗(yàn)證結(jié)果 Roche公司提供的HE4試劑盒生物參考區(qū)間為0.00pmol/L～104.00 pmol/L ，拼裝試劑檢測(cè)20個(gè)健康人血清標(biāo)本濃度范圍在18.24pmol/L～65.15 pmol/L，驗(yàn)證結(jié)果均在儀器說明的參考區(qū)間內(nèi)，該95%生物參考區(qū)間可以采用。

3 討論

按照《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力的專用要求》（ISO15189）對(duì)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)師的認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)，以及美國(guó)頒布的《臨床實(shí)驗(yàn)室修正法案》（ CLIA'88）、衛(wèi)生部《三級(jí)綜合醫(yī)院評(píng)審標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施細(xì)則》、《醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科管理規(guī)范》等文件的要求，凡引進(jìn)和改變的檢測(cè)系統(tǒng)用于常規(guī)檢測(cè)之前，必須對(duì)其主要分析性能進(jìn)行驗(yàn)證，提供相關(guān)的方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，證實(shí)其能夠達(dá)到臨床檢測(cè)所要求的標(biāo)準(zhǔn)[2～5]。

本研究顯示，殘留試劑檢測(cè)HE4 Roche兩個(gè)水平的質(zhì)控血清CV批內(nèi)精密度分別為0.82%、0.50%（未校準(zhǔn)）；批間精密度分別為1.16%、0.76%（未校準(zhǔn)），符合廠商聲明。且殘留試劑與原裝試劑的檢測(cè)結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），說明殘留試劑重復(fù)性良好。參考CLSI EP5-A2文件，用HE4校準(zhǔn)品對(duì)殘留拼裝試劑分別進(jìn)行準(zhǔn)確度驗(yàn)證，相對(duì)偏差（SE%）為0～0.72%，SE%≤1/2CLIA'88允許總誤差（TEa）為可接受，即重復(fù)性良好。對(duì)一個(gè)檢驗(yàn)項(xiàng)目而言，其線性范圍起碼應(yīng)該覆蓋本項(xiàng)目的醫(yī)學(xué)決定水平和常見疾病的檢測(cè)值，實(shí)驗(yàn)中線性結(jié)果分析表明，相關(guān)系數(shù)>0.975，斜率接近1，截距小，各項(xiàng)重復(fù)測(cè)定結(jié)果相關(guān)性好，殘留試劑檢測(cè)標(biāo)本可報(bào)告范圍在本實(shí)驗(yàn)的高、低值范圍內(nèi)的線性理想。試驗(yàn)中各驗(yàn)證 均在給出的生物參考區(qū)間內(nèi)，符合臨床要求。

在工作中應(yīng)注意到不同批次的HE4檢測(cè)試劑，不能混合使用。因?yàn)樵噭┡?hào)不同，試劑所含抗體的濃度及活性有所不同，二維條形碼所包含的參數(shù)信息也不同。并且HE4試劑說明書中指出，未開封試劑可穩(wěn)定到標(biāo)明的保質(zhì)期；試劑一旦開封，放置于2～8的環(huán)境中有效期為8～12w，試劑放置在e601分析儀上的有效期為6w。這是因?yàn)樵噭╅_始使用后，由于溫度變化、水分蒸發(fā)等不利因素，會(huì)引起試劑中包被的單克隆抗體活性減低[5]，進(jìn)而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果誤差。為保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，殘留試劑在妥善保存的情況下應(yīng)在規(guī)定時(shí)限內(nèi)盡快回收利用，使用前必須做兩點(diǎn)定標(biāo)和室內(nèi)質(zhì)控，保證檢驗(yàn)質(zhì)量。

對(duì)殘留拼裝試劑的各項(xiàng)分析性能的評(píng)價(jià)顯示：殘留試劑檢測(cè)HE4的精密度、準(zhǔn)確度、分析測(cè)量范圍和生物參考區(qū)間均符合相關(guān)實(shí)驗(yàn)要求。說明回收的殘留試劑性能穩(wěn)定，質(zhì)量可靠，同批次的殘留試劑在規(guī)定時(shí)限內(nèi)可拼裝再利用，可有效降低檢測(cè)成本。

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編輯/成森