殼寡糖—聚乳酸阿霉素膠團體外緩釋性能考察

摘要：目的 考察阿霉素殼寡糖-聚乳酸嫁接物膠團的緩釋性能。方法 以超聲分散法制備嫁接物膠團；以阿霉素為模型藥物，透析法制備載藥膠團。進行載藥膠團體外釋放實驗，考察殼寡糖-聚乳酸共聚物膠團的緩釋性能。結果 在殼寡糖-聚乳酸嫁接物中，聚乳酸分子量為5000的兩種殼寡糖-聚乳酸嫁接物載藥膠團體外釋放緩釋效果明顯。結論 殼寡糖-聚乳酸聚合物膠團具有顯著的緩釋特征。其中聚乳酸分子量為5000的殼寡糖-聚乳酸嫁接物，緩釋效果更明顯。

關鍵詞：阿霉素；聚合物膠團；藥物載體

聚合物膠團[1]作為一種藥物傳輸系統，有許多優勢：通過調整材料的溶解性、pH值、Zeta電位等可以控制藥物在生物體內的釋放；聚合物膠團骨架對藥物的保護和屏蔽作用，可在一定程度上避免藥物的分解，保持藥物的穩定性，延緩藥物的釋放。聚合物材料的多樣性，使得以聚合物為載體的藥物制劑亦多樣化，能滿足各種使用需求。

本研究采用殼寡糖-聚乳酸嫁接物膠團，研究不同分子量殼寡糖[2]和不同分子量的聚乳酸[3，4]的殼寡糖-聚乳酸嫁接物膠團的理化性質；以親脂性抗腫瘤藥物阿霉素為模型藥物，考察嫁接物膠團的藥物體外釋放行為；探討殼寡糖-聚乳酸嫁接物膠團作為具有緩釋功能的藥物載體的可能性。

1 儀器與材料

1.1 儀器 電子天平（JA2003，上海楚定分析儀器有限公司），超濾離心管（Microcon YM-10，MWCO 10，000，Millipore Co.，USA），透析袋（MWCO 7000da， Spectrum Laboratories， Laguna Hills， CA），透析袋（MWCO 3500da， Spectrum Laboratories， Laguna Hills， CA），微粒粒度與表面電位測定儀（3000HS， Malvern Co.， UK），熒光分光光度儀（F-4600，HITACHI Co.， Japan），恒溫磁力攪拌器（85B-2，南通科學儀器廠），恒溫振蕩器（THZ-82，上海躍進醫療器械四廠），低速離心機（BK-TDZ4-WS，濟南鑫貝西生物技術有限公司），超聲波細胞粉碎機（JY98-ⅢDN，寧波新芝科器研究所）

1.2 材料 CSO（14000）-PLA（10000）嫁接物（自制），CSO（20000）-PLA（10000）嫁接物（自制），CSO（14000）-PLA（5000）嫁接物（自制），CSO（20000）-PLA（5000）嫁接物（自制），芘（Aldrich Chem.Co.，USA），鹽酸阿霉素（Adriamycin.HCl，Adr，浙江海正藥業股份有限公司），其它溶劑或試劑均為分析純。

2 實驗方法

2.1 嫁接物膠團的制備 取10 mg嫁接物精密稱定，溶解于5 ml蒸餾水，探頭超聲20次（400W，工作2s停3s），用蒸餾水定容至10ml，得到1mg/ml的膠團溶液。

2.2 嫁接物膠團的理化性質評價

2.2.1 嫁接物膠團粒徑與表面電位測定 以微粒粒度與表面電位測定儀分別測定嫁接物膠團的粒徑與表面電位。

2.2.2 嫁接物臨界膠團濃度的測定 采用芘熒光分析法測定各嫁接物的臨界膠團濃度（CMC）。分別取嫁接物10 mg，精密稱定，分散于蒸餾水中，探頭超聲20次（400W，工作2s停3s），用蒸餾水定容至10 ml。將1 mg/ml的嫁接物膠團溶液稀釋成不同的濃度（終濃度分別為0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1mg/ml）的分散液各10 ml，分別加入定量的芘（芘的終濃度為7×10-5 mol/L），水浴超聲（40W，30min）。測定熒光強度，計算嫁接物的臨界膠團濃度。

2.3 阿霉素載藥膠團的制備 取阿霉素 5mg溶于10mlDMSO中；取10 mg嫁接物，精密稱定，加入10 ml蒸餾水，探頭超聲20次（400W，工作2 s停3 s），用蒸餾水定容至10 ml，得1 mg/ml的嫁接物膠團溶液；移取嫁接物膠團溶液5 ml，加入5ml阿霉素DMSO溶液，置于透析袋（MWCO 3500 Da， Spectrum Laboratories， Laguna Hills， CA）中，外相為1L純水，在磁力攪拌條件下透析6h。離心除去未增溶的藥物（4000 r/min，10 min），得到嫁接物載藥膠團溶液。

2.4 嫁接物載藥膠團粒徑與表面電位測定 取嫁接物載藥膠團溶液適量，以微粒粒度與表面電位測定儀分別測定嫁接物載藥膠團的粒徑與表面電位。

2.5 嫁接物載藥膠團的藥物包封率、載藥量以及藥物體外釋放

2.5.1 阿霉素的含量測定 采用熒光分光光度法測定阿霉素的含量；采用逐步稀釋法制備藥物在純水、甲醇：水=4：1（v：v）和pH=7.4的PBS三種溶劑中的標準曲線：熒光強度I對藥物濃度的曲線。激發波長為471 nm，發射波長為558 nm。激發狹寬和發射狹寬設置為5 nm。

2.5.2 嫁接物載藥膠團的藥物包封率、載藥量測定 采用超濾離心法考察嫁接物載藥膠團的藥物包封率；取0.5 mg/ml的載藥膠團溶液0.2 ml，加入0.8ml甲醇，破壞膠團后，以甲醇：水=4：1（v：v）溶液稀釋至適當濃度，用熒光分光光度法測定藥物總濃度（Co）。另移取載藥膠團溶液0.2 ml，置0.4 ml超濾離心管中（Microcon YM-10，MWCO 10，000，Millipore Co.，USA），10，000 r/min的速度離心10min，以純水稀釋至適當濃度，用熒光分光光度法測定濾液中游離藥物濃度（C）。按（2.1）式和（2.2）式分別計算藥物包封率和載藥量。

公式：包封率（%）=（Co-C）/ Co ×100%，（2.1）；

載藥量（%）=（Co-C）/（500+Co-C） ×100%，（2.2）。

2.5.3 嫁接物載藥膠團體外釋放研究

2.5.3.1 阿霉素在釋放介質PBS中的飽和溶解度測定 取1 mg的阿霉素于釋放管中，加入20 ml PBS溶液，放在37℃恒溫、振蕩頻率為60 r/min的恒溫振蕩器中。在2h、4h、6h、12h、24h、48h、72h取樣，并用熒光光度法測定阿霉素堿基的濃度，最后得到藥物在PBS中的飽和溶解度。

2.5.3.2 嫁接物載藥膠團體外釋放 載藥膠團的體外釋放在37℃恒溫、振蕩頻率為60 r/min條件下進行。取載藥膠團溶液0.5 ml置透析袋中（MWCO 7000 Da， Spectrum Laboratories， Laguna Hills， CA），釋放介質為75 ml pH=7.4的PBS溶液。定時取樣1 ml，同時加入1 ml PBS溶液，用熒光分光光度法測定樣品中的阿霉素的濃度，計算藥物的累積釋放量和累積釋放率。

3 結果

3.1 嫁接物的臨界膠團濃度 各嫁接物膠團的臨界膠團濃度（見表1）。殼寡糖的分子量為20000、聚乳酸的分子量為10000，投料比為1：1的CSO-PLA嫁接物的I1/I3的比值對嫁接物濃度的變化圖例（見圖1）。

圖1 CSO（20000）-PLA（5000）的I1/I3的比值變化

3.2 阿霉素載藥膠團的理化性質

3.2.1 CSO-PLA載藥膠團的粒徑與表面電位 本研究采用0.5mg/ml的嫁接物膠團溶度，進行阿霉素堿基的載藥實驗。嫁接物膠團的粒徑與表面電位以及嫁接物載藥膠團的粒徑與表面電位結果（見表2）。

3.2.2 CSO-PLA載藥膠團的藥物包封率以及體外釋放

3.2.2.1 阿霉素的含量測定 本實驗采用熒光分光光度法測定阿霉素的濃度，將熒光強度I與阿霉素的濃度C（ng/ml）進行回歸，采用逐步稀釋法得到藥物在純水、甲醇：水=4：1（v：v）和pH=7.4的PBS中熒光強度I對阿霉素的濃度C的標準曲線，三條標準曲線分別為Y=0.3307X+0.2749，R2=0.9996（阿霉素范圍10ng/ml～5000 ng/ml） 、Y=0.5138X+34.506，R2=0.9993（阿霉素范圍10ng/ml～5000 ng/ml）和Y=0.0.3722X+10.779，R2=0.9996（阿霉素范圍10ng/ml～1000 ng/ml）有很好的線性相關性。

3.2.2.2 阿霉素載藥膠團的包封率測定 采用超濾離心法測定的阿霉素在藥膠團的藥物包封率結果（見表3）。

3.2.2.3 載藥膠團體外釋放研究 本實驗選用pH為7.4的PBS為釋放介質。經測定阿霉素在pH為7.4的PBS中的飽和溶解度為3.0μg/ml。CSO（14000）-PLA（10000），CSO（20000）-PLA（10000），CSO（14000）-PLA（5000），CSO（20000）-PLA（5000）載藥膠團的體外釋放特征（見圖2）。

圖2 CSO（14000）-PLA（10000），CSO（20000）-PLA（10000），CSO（14000）-PLA（5000），CSO（20000）-PLA（5000）載藥膠團和純藥的體外釋放曲線。

4 討論

殼寡糖化學結構[5]中含有大量氨基，本身帶正電荷。部分氨基被烷基取代后的聚合物，仍然保留了相當數量的氨基，所形成的膠團，其表面電位仍為正值。CSO-PLA載藥膠團的粒徑較載藥前都大大減小，這說明大量藥物已經進入膠團的疏水性內核后，膠團分子中的疏水性鏈段與親脂藥物之間的疏水性相互作用增加了膠團的聚合能力，從而使膠團體積減小。當聚乳酸的分子量一定時，隨著殼寡糖分子量的增加，其包封率和載藥量有所提高。由化學嫁接得到的兩親性殼寡糖-聚乳酸聚合物，在水性環境中可自發形成膠團。這種聚合物膠團具有比較低的臨界聚集濃度和較小的粒徑。以抗腫瘤藥物阿霉素為模型藥物，發現該聚合物可以作為疏水性藥物的儲庫，具有一定的載藥能力。

當聚乳酸的分子量一定時，隨著殼寡糖分子量的增加，其包封率和載藥量有所提高。從載藥膠團的體外釋放特征來看，聚乳酸分子量為10000的兩組聚合物膠團開始有突釋的特征，可能是因為藥物與嫁接物之間的結合力小而導致了快速的釋放，4h后藥物緩釋釋放。聚乳酸分子量為5000的兩組載藥膠團釋放速度較慢，可能由于其疏水部分結合力較強（粒徑較小），形成的膠團穩定，并與藥物的結合力強，釋放速度減慢，呈現一定的緩釋特征。

參考文獻：

[1] 許鴦雁，牛泱平.聚合物膠團在腫瘤治療中的應用[J].現代醫藥衛生，2010，26（17）.

[2] HU z p.research advances in chitooligosaccharides[J].Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics，2003， 24（4）210-212

[3]ZHANG g d，yang j y，feng x d，gu z w.progress in study of polylactides[J].Progress in Chemistry，2000，12（1）：89-102.

[4] MA q，yang q f，yao j y.study of the synthesis of poly（lactic acid）[J].Polymer Materials Science Engineering，2004，20（3）34-35.

[5]JI y，zhao y，zhou x，et al.The Preparation of Chitosan Oligomer and the Components Analysis[J].Chinese Journal of Modern Applied Pharmacy，2003， 20（3）195-196.

編輯/成森