獼猴桃采后致病菌的分離及中草藥提取物對其抑菌效果初探

摘要：獼猴桃果實在常溫下極易軟化和腐爛變質(zhì)，即使放置于0-4℃的低溫冷庫巾，也很容易產(chǎn)生各種霉菌。為深入研究獼猴桃采后果實的主要致病菌，以湖南獼猴桃主產(chǎn)區(qū)病果為試材，分離篩選出3種具有較強致病件且具有獨特性狀的致病菌。經(jīng)過初步篩選發(fā)現(xiàn)，川芎和高良姜提取物對3種致病菌均有較好的抑制作用。

關(guān)鍵詞：獼猴桃；致病菌；分離；中草藥提取物；抑菌作用

中圖分類號：S436.634.12

文獻標識碼：A

文章編號：1006-060X（2015）05-0081-03

獼猴桃是深受消費者和果農(nóng)喜愛的水果。采收期在9-10月，很多地方正值氣溫較高的季節(jié)，加之獼猴桃是呼吸躍變型果實，在常溫下極易軟化和腐爛變質(zhì)。獼猴桃不耐貯藏很大程度上是因為貯藏期間有青綠霉或者軟腐病狀的病菌侵入引起了各種病害及腐爛。因此采收后應盡快放在適宜的貯藏條件下，并采取有效的防腐保鮮措施。

隨著湖南省獼猴桃產(chǎn)量的不斷增加，獼猴桃的貯藏將成為一個迫切需要解決的難題。為了讓消費者吃到安全而又衛(wèi)生的水果，各個國家的科學家都在致力于尋找一種新的保鮮技術(shù)、一種能夠代替化學藥物的保鮮產(chǎn)品。同時，非化學性的殺菌劑用來控制果實采后的病害將成為以后長時間的研究熱點并形成一個發(fā)展方向。很多研究發(fā)現(xiàn)，植物的粗提物和它的揮發(fā)油等用于控制果蔬采后致病菌具有非常好的效果。

1 材料與方法

1.1 供試材料

獼猴桃病果來源于湖南省獼猴桃主產(chǎn)區(qū)及湖南省園藝研究所白有冷庫；新鮮果實于湖南省園藝研究所果園摘取。

1.2 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基的配制

取200g清洗干凈并去皮的馬鈴薯，切成2cm的小塊，放入干凈的鍋巾，煮沸30min，用紗布過濾至三角瓶中，隨后加入20g葡萄糖和20g瓊脂，待其充分融化后，加水至1000mL，121℃高壓滅菌20min，冷卻后儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 感病獼猴桃病原菌的分離

用試驗專用刀將獼猴桃果實的感病組織切下，用接種針挑取放入70%的酒精巾浸泡30s左右，迅速放人1%的次氯酸鈉溶液巾浸泡lmin，隨后用無菌水清洗2-3次，放入倒好PDA培養(yǎng)基的平板中，置于28℃培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)3d左右。分離純化3次獲得純化菌種后移入試管中，放入4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病原菌的回接驗證及分析鑒定

取分離到的病原菌，采取有傷接種的方式，將其接種到表面干凈并消過毒的健康果實上。接種過的果實放置于帶有加濕功能的培養(yǎng)箱中常溫培養(yǎng)。如果重新接種后果實發(fā)病的病狀與貯藏時病果的癥狀相符合，隨后從發(fā)病的果實上再次分離得到病原菌。參照魏景超的《真菌鑒定手冊》做進一步的鑒定。

1.5 病原菌致病性試驗

將長勢良好的適齡PDA培養(yǎng)基平板上的菌落用滅過菌的打孔器打出直徑為4mm的菌餅，留以備用。將新鮮的獼猴桃果實表面消毒后，采用刺傷接種的方式，將打好的菌餅菌絲面緊貼在果實表面上。放入清洗干凈的瓷盤中進行保濕，隨后置于培養(yǎng)箱中常溫培養(yǎng)。

定期觀察接種后果實發(fā)病的情況并測量病斑的直徑，根據(jù)發(fā)病果實的病斑大小判斷該病菌致病性的強弱。無致病性的將其記為“-”，有致病性的記為“+”，致病性的強弱分別采用1、2、3、4個“+”表示，劃分該強弱的標準分別為病斑直徑x≤5mm、5mm

1.6 中草藥提取物對病原真菌的抑制作用

采用生長速率法，將巾草藥提取液和PDA培養(yǎng)基混合均勻制成帶藥培養(yǎng)基，隨后倒入9cm的培養(yǎng)皿巾，冷卻。在平板培養(yǎng)皿巾央接種直徑為4mm的病菌菌餅。早期篩選發(fā)現(xiàn).當巾草藥提取液濃度為8.25mg/mL時，抑菌效果最好。以相同量的無菌水代替藥液作為對照，提取物對類似青霉病原菌的抑菌效果采用改良的生長速率法。

菌落直徑采用十字交叉法，測量3次重復求平均數(shù)；根據(jù)菌落直徑計算菌絲生長相對抑制率（%）=（對照的菌落直徑一處理的菌落直徑）/對照的菌落直徑×lOO。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分析

根據(jù)常規(guī)組織分離法從采集回的獼猴桃發(fā)病果實內(nèi)分離出9株致病真菌，其命名如表1所示，將他們置于PDA培養(yǎng)基、28℃培養(yǎng)箱巾培養(yǎng)，觀察其形態(tài)發(fā)現(xiàn)，青I-I，青4-1-1，青4-1-2，青4-2，青9-2，青11-2，青12-4菌落形態(tài)特征一致。綠1和灰1分別為特異性狀致病菌。

2.1.1 青霉菌的菌落形態(tài) 菌落的顏色呈現(xiàn)出暗青色，粉粒狀，生長速度較快，邊緣呈白色。從背面觀察培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)由淺黃色慢慢變?yōu)辄S褐色，并隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸加深。鏡檢觀察分生孢子梗無色，一端具1-3個分枝，掃帚狀；分生孢子呈念珠狀串生，單孢無色，近球形；該菌株在果皮及內(nèi)部形成，開始為水漬狀，邊緣不明顯，之后長出菌絲，慢慢形成青色霉層，深褐色水漬斑擴展，有較重霉味。綜合特征及其引起的癥狀，將病菌命名為青霉菌。

2.1.2 黃腐病菌的菌落形態(tài)菌落直徑生長至9cm，覆蓋住整個培養(yǎng)皿。培養(yǎng)初期，菌落生長為白色，氣生菌絲稀疏，呈絨毛狀，后來慢慢變?yōu)榫G色。在培養(yǎng)基的表面和培養(yǎng)基底部會形成黑色的顆粒狀物，為分生孢子器。分生孢子在顯微鏡下觀察為無色，單胞，橢網(wǎng)形。綜合上述特征及其引起的病狀，將此病擬命名為黃腐病。

2.1.3 交鏈孢霉菌的菌落形態(tài)菌落生長速度較快，菌落呈絨毛狀，其顏色多為灰黑色至黑色。菌落巾央為灰色，菌絲暗至黑色，有隔膜，有分生孢子。在顯微鏡下觀察到分生孢子倒棒狀，其顏色為淡褐色，有分隔，孢子的形態(tài)及大小不規(guī)律，根據(jù)其引起的病狀特征同時參閱相關(guān)文獻將此病菌命名為交鏈孢霉菌。

2.2 致病性驗證

將新鮮的獼猴桃果實表面消毒后，采用刺傷接種的方式，將分離到的病原菌接種在獼猴桃果實表面，致病性結(jié)果見表1。由表1可知，在刺傷條件下，9個分離得到的病原菌均能使獼猴桃果實致病。其中致病性最強的為青11-2，致病性達到了“++++”；致病性最弱的為青1-1，致病性僅為“++”。對接種后發(fā)病的果實病斑進行再分離，又得到與純化后病菌性狀一致的病原菌。

2.3 中草藥提取物對致病菌的離體抑制效果

參照陳年春的生長速率法，選取3株有獨特性狀且具有較強致病性的致病菌，通過帶毒培養(yǎng)基試驗進行初步篩選，發(fā)現(xiàn)川芎和高良姜提取物對3種致病菌有較好的抑制作用。由表2可知，川芎提取物對致病菌綠1、灰1、青4-1的菌絲生長相對抑制率分別達到82.56%、88.40%、94.l9%；高良姜提取物對致病菌綠1、灰1、青4-1的菌絲生長相對抑制率分別達到71.51%、60.87%、79.07%.

3 結(jié)論與討論

以獼猴桃為研究對象，針對獼猴桃采后貯藏期間真菌危害致腐而長期無法突破的難題開展研究。研究將巾草藥提取物川芎和高良姜用于獼猴桃貯藏期間常見低溫病害軟腐病和青綠霉菌病，對突破獼猴桃貯藏保鮮技術(shù)瓶頸具有重要意義。項目研究結(jié)果如加以純化利用可直接用于生產(chǎn)具有巾草藥活性成分的保鮮紙和保鮮袋，可將其用于獼猴桃生產(chǎn)上的貯藏保鮮。