冷誘導基因轉(zhuǎn)化檸檬的研究

摘要：將包含載體pPtcor∷8Ptcor8∷YFP的農(nóng)桿菌EHA105轉(zhuǎn)入到不抗寒的檸檬中，并對轉(zhuǎn)化體系進行了優(yōu)化。研究結(jié)果表明，再生培養(yǎng)基中的6-BA的濃度，卡那霉素（Kan）濃度以及除草劑（Basta）的濃度對檸檬的轉(zhuǎn)化效率有明顯影響；再生培養(yǎng)基配方為MT+0.5mg/L6-BA，添加75mg/Lkan或10mg/LBasta時能夠有效篩選到抗性芽，并獲得了3株轉(zhuǎn)基因檸檬植株，YFP陽性率為3.6%。

關鍵詞：尤力克檸檬；農(nóng)桿菌介導；遺傳轉(zhuǎn)化；YFP

中圖分類號：S666.5

文獻標識碼：A

文章編號：l006-060X（2015）05-0074-03

凍害是柑橘生產(chǎn)上的主要災害之一，能夠造成大面積減產(chǎn)和嚴重經(jīng)濟損失。目前，人們已開始逐步探索利用基因工程手段進行植物抗寒育種和有關生理研究，并利用基因工程手段提高植物的抗寒性。筆者前期從枳巾克隆得到1個低溫鍛煉相關基因Ptcor8，該基因在不同柑橘種類巾表達量不同，在枳巾的表達量最大，是金柑的3.4倍，柚的4.4倍，甜橙的4.7倍，檸檬的25.5倍，其與柑橘的耐寒力呈正相關。比較柑橘不同種類中同源基因的啟動子，發(fā)現(xiàn)枳的啟動子pPtcor8與檸檬啟動子pClcor8的同源性為88.17%，且枳pPtcor8擁有檸檬pClcor8沒有的3個與逆境響應相關的特有調(diào)控元件。筆者構(gòu)建了pPtcor8∷Ptcor8∷YFP融合表達載體，將其轉(zhuǎn)入不抗寒的檸檬中，以探究轉(zhuǎn)基因檸檬植株在低溫脅迫下Ptcor8的表達量的變化。

柑橘的遺傳轉(zhuǎn)化通常采用農(nóng)桿菌介導法進行，并且在甜橙、金柑、枳、葡萄柚中已獲得成功，但在檸檬上報道較少。提高檸檬轉(zhuǎn)化效率的研究主要集巾在對再生條件、不定芽的篩選條件等影響因素上。如果得到穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株，可為探究柑橘抗寒的分子機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料及農(nóng)桿菌菌株 試驗種子為尤力克檸檬種子，果實產(chǎn)于云南；農(nóng)桿菌EHA105包含載體pPtcor8∷Ptcor8∷YFP，載體T-DNA區(qū)段巾包含枳冷誘導啟動子pPtcor8，枳冷誘導基因Ptcor8，報告基因YFP。

1.1.2 培養(yǎng)基的配制 播種培養(yǎng)基為MT，pH 5.7；生根培養(yǎng)基為1/2MT+0.5mg/LNAA+O.1mg/LIBA，pH5.7；重懸液為MT（不加瓊脂）+3.O mg/L 6-BA+20 mg/LAS，pH 5.7；共培培養(yǎng)基為MT+3.OmgL6-BA+20mg/L AS，pH 5.7；LB（Luria-Bertan）培養(yǎng)基為5 g/L酵母提取物（Yeast extract）+10g/L蛋白胨（Tryptone）+10g/L NaCl+15g/L瓊脂，pH 7.O。

1.2 方法

1.2.1 檸檬實生苗上胚軸的獲得檸檬種子去除外種皮，在超凈工作臺上用75%酒精消毒1min，再用1%NaCIO溶液消毒20min，然后用無菌水清洗數(shù)次，將種胚播種于播種培養(yǎng)基上，于26℃條件下，先暗培養(yǎng)20d，再光照培養(yǎng)10d。然后選擇粗約2mm的檸檬實生苗，將其上胚軸斜切成1cm左右的節(jié)間莖段，用于遺傳轉(zhuǎn)化。

1.2.2 農(nóng)桿菌侵染檸檬運用農(nóng)桿菌介導法，將農(nóng)桿菌培養(yǎng)在含100mg/L Kan和25mg/L Rif的LB液體培養(yǎng)基上，28℃、200r/min搖菌24h至OD600為0.5-1.O。常溫12000r/min離心10min后去除上清液，再用重懸液重懸至OD600為0.6左右。外植體侵染15min后轉(zhuǎn)入到共培培養(yǎng)基上19℃暗培養(yǎng)3d后，移入篩選培養(yǎng)基上。

1.2.3 6-BA濃度的篩選為確定適合檸檬實生苗上胚軸節(jié)間莖段再生的合適培養(yǎng)基，培養(yǎng)基巾的6-BA濃度設置0mg/L、0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、3mg/L等5個水平，分別將節(jié)間莖段水平放置到不同6-BA濃度的再生培養(yǎng)基巾，先暗培養(yǎng)3d，再置于光照下培養(yǎng)，45d后統(tǒng)計不定芽再生率。

1.2.4 卡那霉素濃度篩選共培養(yǎng)3d后，將檸檬實生苗上胚軸節(jié)間莖段水平放置于添加不同濃度Kan的MT+0.5mg/L 6-BA+500mg/L Cef培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)基巾的Kan濃度設置0mg/L、50mg/L、75mg/L和100mg/L4個水平，設3次重復，45d后統(tǒng)計不定芽再生率。

1.2.5 除草劑濃度篩選共培養(yǎng)3d后，將檸檬實生苗上胚軸節(jié)間莖段水平放置于添加不同濃度Basta的MT+0.5mg/L 6-BA+500mg/L Cef培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)基巾的Basta濃度設置Omg/L、5mg/L、7.5mg/L、10mgL和15mg/L5個水平，設3次重復，45d后統(tǒng)計不定芽再生率。

1.2.6 抗性芽的熒光檢測在超凈工作臺上，將抗性芽的葉片切下并編號，立即采用尼康SMZIOOO體式顯微鏡，配合奧林巴斯DP72顯微拍照系統(tǒng)對抗性芽葉片進行熒光檢測并拍照，之后將抗性芽葉片4℃低溫處理3h后再次進行熒光檢測并拍照。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析選擇莖高0.3cm以上的不定芽，計算YFP陽性率和不定芽再生率，汁算公式如下：

YFP陽性率=（YFP陽性芽總數(shù)/總節(jié)間莖段數(shù)）×100%

不定芽再生率=（不定芽總數(shù)/節(jié)間莖段總數(shù)）×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 6-BA濃度的篩選

選擇MT培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度6-BA進行試驗的結(jié)果見表1，添加6-BA后不定芽的再生能力顯著提高，但當6-BA濃度超過0.5mg/L時不定芽的再生能力下降，以MT+0.5mgL 6-BA培養(yǎng)基的再生能力最強，其再生率為96.4%，顯著高于其他處理。所以在后續(xù)試驗巾均采用MT+0.5mg/L6-BA培養(yǎng)基。

2.2 卡那霉素濃度篩選

以MT+0.5mg/L 6-BA+500mg/L Cef為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度Kan進行試驗的結(jié)果見表1，添加Kan后明顯抑制了不定芽的再生，當濃度升高至75mg/L時不定芽不再生長，但節(jié)間莖段依然為綠色，而濃度升高至100mg/L時檸檬節(jié)間莖段則完全黃化死亡。所以確定適合檸檬轉(zhuǎn)基因植株篩選的Kan濃度為75mg/L。

2.3 除草劑濃度篩選

以MT+0.5mg/L 6-BA+500mg/L Cef為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度Basta進行試驗的結(jié)果見表1，加入低濃度的Basta后檸檬不定芽的再生能力急劇下降，當濃度為10mg/L時不定芽再生能力就被完全抑制，繼續(xù)提高濃度至15 mg/L時節(jié)間莖段黃化，完全無愈傷組織的形成。所以確定適合檸檬轉(zhuǎn)基因植株篩選的Basta濃度為10mg/L。

2.4 檸檬抗性芽的檢測

將得到的抗性芽與非轉(zhuǎn)基因不定芽分別經(jīng)過常溫（30℃）和低溫（4℃）處理后，發(fā)現(xiàn)只有轉(zhuǎn)基因抗性芽葉片經(jīng)4℃冷處理后才能檢測到不均勻的黃色熒光，非轉(zhuǎn)基因不定芽經(jīng)常溫、低溫處理，轉(zhuǎn)基因不定芽經(jīng)常溫處理均沒有黃色熒光。非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因抗性芽經(jīng)常溫處理葉片都沒有熒光現(xiàn)象，表明pPtcor8基因在常溫表達量很少或不表達。轉(zhuǎn)基因抗性芽經(jīng)低溫處理后葉片可檢測到不均勻的黃色熒光，低溫處理3h可以誘導Ptcor8基因的表達，所以非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因抗性芽都經(jīng)低溫處理后，只有轉(zhuǎn)基因的抗性芽才有熒光表達，因此將得到的不定芽進行低溫處理后能夠檢測到不均勻的黃色熒光的不定芽就是轉(zhuǎn)基因抗性不定芽。現(xiàn)已獲得3株轉(zhuǎn)基因檸檬苗，YFP陽性率為3.6%（表2）。

3 小結(jié)與討論

檸檬的轉(zhuǎn)基因研究較少，轉(zhuǎn)化效率也很低，1990年Vardi等利用PEG介導轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體獲得了首例轉(zhuǎn)基因檸檬植株。黃家權(quán)對檸檬的轉(zhuǎn)基因技術(shù)進行了研究，并成功的將ICEI基因?qū)霗幟手小１狙芯繀⒖纪跞蜗璧姆椒ǎ詸幟噬吓咻S為轉(zhuǎn)化受體，獲得了較為理想的轉(zhuǎn)化率。 農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化檸檬的影響因素有很多，如農(nóng)桿菌菌株的不同，外植體的培養(yǎng)方式，共培養(yǎng)的時間，再生培養(yǎng)方式，以及菌液的濃度等，其巾尤為關鍵的是再生條件以及篩選壓的選擇。再生培養(yǎng)基巾需要加入一定濃度的抗生素，理論上較高濃度的抗生素有利于篩選出抗性不定芽，但是也會強烈抑制不定芽的產(chǎn)生，所以選擇合適濃度的抗生素是能否得到抗性芽的關鍵。本實驗對再生培養(yǎng)基巾的6-BA，卡那霉素以及除草劑濃度進行了篩選，得出最佳的再生培養(yǎng)基為MT+0.5mg/L 6-BA，添加75mg/L Kan或10mg/LBasta。

對得到的抗性芽進行熒光檢測，只有轉(zhuǎn)基因不定芽經(jīng)4℃低溫處理后有熒光現(xiàn)象，驗證了Ptcor8基因的啟動子在常溫下不表達，經(jīng)低溫處理后才能表達，最后成功的將pPtcor8∷Ptcor8∷YFP融合表達載體轉(zhuǎn)入到檸檬巾，YFP陽性率為3.6%，獲得了3株轉(zhuǎn)基因檸檬植株，為驗證柑橘抗寒的相關基因和啟動子奠定了基礎。