骨形態發生蛋白9的研究進展

摘要：骨形態發生蛋白9（BMP-9）是轉化生長因子超家族的成員之一，已知BMP家族中成骨活性最強的成員；Smad蛋白在其信號傳導中起重要作用；BMP-9腺病毒為載體表現出強大成骨能力；BMP-9還具有促進原始神經元乙酰膽堿的合成，調節造血干細胞，降低血糖等作用。

關鍵詞：骨形態發生蛋白9；信號通路；成骨作用；腺病毒

骨形態發生蛋白（bone morphogenetic proteins，簡稱BMPs）是轉化生長因子（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族的成員之一，在人體內由肝臟合成并分泌，具有多種生物學功能，尤其是骨誘導能力，現已成為了醫學界的研究熱點，特別是為難以突破的骨缺損修復問題提供了新的治療方法，現階段BMP家族中的BMP-2和BMP-7以被成功應用到臨床治療中，并取得了良好的效果。BMP-9又稱GDF2（growth differentiation factor 2），是已知BMP家族中成骨活性最強的成員，因其骨誘導活性不會受到免疫反應的較大抑制，故也是該家族中唯一能在有免疫能力的活體動物體內顯著誘導骨形成的成員。目前研究已證實，動物模型中BMP-9可有效地修復骨缺損。現階段BMP-9 的成骨機制、成骨作用、表達純化方法、載體及支架材料的選擇已經成為目前研究工作的熱點和重點。

1基本特征

BMP9（也稱GDF-2，growth differentiation factor 2）是BMPs 中的一種，主要由肝臟分泌并完成表達，其免疫原性較低，通常不會引起免疫排斥反應，只具有輕微的免疫刺激能力。BMP9從結構上看為高度保守的糖蛋白，對核酸酶以及膠原酶等大部分蛋白酶不敏感，只對胰蛋白酶和糜蛋白酶敏感。現已經證實BMP9具有誘導和維持胚胎神經元的類膽堿分化、調節葡萄糖和脂肪酸代謝、調節體內鐵的動態平衡等多種重要功能，BMP-9通常會以前體和二聚體的形式存在，其在結構上不含有第7保守半胱氨酸這一特點與絕大多數TGF-β超家族成員相區別[1-2]。人BMP-9的基因位于染色體10q1 1.22，它的前體蛋白包含428個氨基酸殘基，該氨基酸序列中有50%-55%與BMP-2，4，5，6，7，8相同，人與鼠的BMP-9有80%的同源性[3-4]。

2信號傳導通路

2.1 Smad蛋白 現有的研究已經確認Smad蛋白在TGF-β超家族成員的信號轉導中具有重要的作用。TGF-β超家族的二聚配體與細胞膜表面的Ⅱ和Ⅰ型絲氨酸 /蘇氨酸激酶受體結合形成異四聚復合體。活化后的Ⅰ型受體使R-Smad磷酸化 ，磷酸化的R -Smad與Co-Smad形成異聚復合體，進入細胞核與其它轉錄協同子和抑制子共同調節靶基因的轉錄。且不同的Smad介導不同的TGF-β家族成員的信號轉導。到目前為止，已經從哺乳動物體內分離和鑒定出8種Smad蛋白，按功能分為3類：即受體活化型（或稱通路限制型）、共同通路型和抑制型。其中、受體活化型具有介導BMPs通路的作用；共同通路型通過與細胞核內的特異蛋白一起結合到細胞的DNA上調控靶基因的轉錄；抑制型通過與Ⅰ型受體結合而抑制BMPs配體的活性[5-7]。

2.2依賴 Smads 信號傳導通路與非依賴Smads 信號傳導通路 在BMPs信號傳導通路的過程中，異源二聚體受體與BMPs配體結合后，Ⅱ型受體的轉磷酸作用使Ⅰ型受體在絲氨酸/甘氨酸區被磷酸化，從而激活Ⅰ型受體，Smad 1、Smad 5、Smad 8 羧基端上的絲氨酸序列會在其絲氨酸激酶的作用下磷酸化從而將信號傳入至細胞內。接下來兩個或者兩個受體調控的Smad蛋白分子與一個Smad 4會形成一個異源性三聚體或著形成一個異源二聚體進入到細胞核內，核轉錄因子與核內Smads蛋白的MH2區域進行結合，作用于目的基因[8-9]。

MAPK信號傳導通路是目前研究最多的非依賴Smads 信號傳導通路。MAPK是一種蘇氨酸/絲氨酸蛋白激酶，主要有細胞外相關信號蛋白激酶（ERK），兩個應激活性蛋白激酶（JNK），以及p38 MAPK三種類型[10]。它參與細胞的增殖分化、不同種細胞間的相互作用、細胞的惡變。Gresser WA等人的研究表明以上三種蛋白激酶都能提高成骨分化能力[11]。

2.3 BMP-9成骨信號傳導通路 現有研究表明經典Wnt 信號通路、Hey1、堿性螺旋-環-螺旋蛋白和過氧化物酶增殖體活化受體2、激活素受體樣激酶1 和2、胰島素生長因子2 及類維生素A 等都與BMP-9的骨誘導過程有關。BMP-9在結構上有別于TGF-β超家族的其他成員，其型號傳導通路也有所不同。KangQ等人研究表明，具有成骨作用的BMP-2/6/7，在受到骨形成的負性調節因子的BMP-3的作用時，骨形成能力受到較大的抑制，然而對BMP-9卻不能發揮作用[12]。HepG2肝腫瘤細胞能大量表達BMP-9的兩種高親和性受體（約為54 kD和80 kD），但這兩種受體卻不能與BMP 3，5，6結合，而僅與BMP-2，4 在有限的程度內結合[13]。這些研究都表明BMP-9存在與TGF-β超家族的其他成員不同的受體，也有可能存在新的信號傳導通路。此外胰島素生長因子2，類維生素A也與BMP-9發揮作用密切相關。

3 BMP-9與骨形成

3.1 BMP-9與腺病毒 BMP-9的成骨作用須與良好的載體結合，在生物體內發揮作用。以腺病毒為載體的BMP-9表現出了強大的正位和異位骨誘導活性。在BMPs誘導脊柱融合的實驗中，將Ad-BMP-9和Ad-BMP-2經脊柱旁肌肉組織直接注射后證實有明顯的骨質沉積作用，使脊柱融合。Ad-BMP-9誘導椎旁肌肉組織骨發生的作用比Ad-BMP-2更強[14]。Cheng等的研究發現以腺病毒為載體的14種人BMP（BMP2-15），作用于成骨細胞祖細胞C3H10T1/2和C2C12后，BMP9、2、6三組骨鈣素的表達明顯，細胞內礦化結節的形成最為顯著，此外在成骨細胞系的培養過程中加入BMP9、2、6重組腺病毒后，堿性磷酸酶（ALP）顯著表達，這表明BMP-9以及BMP2，6 具有較強的骨誘導能力[15]。Li 等將5種重組人BMP（rhBMP）腺病毒轉染的C2C12細胞，植入無胸腺裸鼠和SD大鼠體內，在相同劑量下測得Ad-BMP-9組ALP活性最高。裸鼠中新骨形成平均體積Ad-BMP-9僅次于Ad-BMP-6，4，而SD大鼠內Ad-BMP-9在較BMP-6低100倍的劑量下就能誘導更多的骨，其他則無骨形成16。這表明Ad-BMP-9在SD大鼠中的成骨活性最強，同時也提示BMP-9信號途徑可能不受宿主免疫反應的明顯限制。Abdelaal 等將BMP-9以腺病毒為載體注人裸鼠背闊肌中，連續3 w每周行肌肉組織活檢，第3 w后出現X型膠原、骨橋素（OPN）等軟骨和骨標志物，明顯觸摸到肌肉內骨組織[17]。

3.2 BMP-9與其他載體 甘強等人以真核質粒為載體成功構建表達質粒pcDNA4/His Max-BMP-9，但真核表達系統純化出的 rhBMP-9 的骨誘導活性不及rhBMP-218。間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是屬于中胚層的一類多能干細胞，具有強大的增殖能力和多向分化潛能，在適宜的體內或體外環境下不僅可分化為成骨細胞，還μ具有分化為肌細胞、軟骨細胞、基質細胞、肝細胞等多種細胞的能力。江等人研究表明BMP-9基因修飾的骨髓間充質干細胞MSCs成骨能力較單純MSCs明顯增強[19]。Bessa等從細菌克隆中得到人BMP-9cDNA全長序列，通過PCR 擴增、質粒重組、轉染得到表達BMP-9蛋白的大腸桿菌。LB培養基中培養轉染后的大腸桿菌、離心、收集上清液（包含溶解的重組人BMP-9），運用帶His 標簽的層析柱和脫鹽柱過濾上清液，得到純化率95%的BMP-9，并證明了其具有較高生物活性[20]。此外、天然生物材料包括膠原（collagen）、脫鈣骨基質（demi-neralized bone matrix，DBM）、藻酸鹽（alginate）、透明質酸、殼聚糖等； 人工合成高分子材料聚乳酸羥基乙酸共聚物（PLGA）也都納入了研究范圍。

4 BMP-9的其他生物學作用

在神經系統中BMP-9促進胚胎鼠原始神經元的乙酰膽堿（ACh）的合成，可誘導膽堿乙酰基轉移酶和乙酰膽堿小泡轉運體的表達。BMP-9 與成纖維細胞生長因子（ bFGF） 在神經系統的發育中起協同作用，BMP-9保持種族特異性，而bFGF保持原始細胞特性的一致性[21]。

BMP-9 在調節造血干細胞的生長中有雙向作用，高濃度的BMP9對造血干細胞的生長有抑制作用，低濃度的BMP9則產生促進作用。Lopez-CoviellaI的研究報告表明，用無血清培養基時，BMP9的濃度達到100 μg/ml可以完全抑制體外克隆的造血祖細胞集落形成單位（CFU-C）增長的效應，反之，當BMP-9的濃度為3 μg/ml是可產生促進增長效應[22]。

實驗數據顯示，為糖尿病大鼠單一注射BMP-9 就可使血糖降低并接近正常水平。對大鼠監測發現BMP-9可能通過促進胰腺β細胞釋放胰島素、調節肌肉中的糖原合成激酶及抑制肝糖產生降低血糖[23]。BMP-9 能提高脂代謝關鍵酶的表達，促進蘋果酸酶和脂肪酸合酶的合成，在調節肝脂肪酸合成過程中有重要作用[24]。

5展望

BMP-9骨誘導作用的研究已取得一定進展，在動物模型中已成功地進行骨缺損修復和脊柱融合的基因治療。現有的研究也已證明其是BMPs家族中成骨能力最強的成員，但BMP-9的基本結構、誘導骨形成的機制以及載體的選擇等問題尚不完全明確，隨著研究的深人，BMP9必將有著廣闊的臨床應用前景。

參考文獻：

[1]Groeneveld EH， Burger EH. Bone morphogenetic proteins in human bone regeneration [J]. Eur J Endocrinol， 2000，12（1）：9-21.

[2]SieberC ，S chwaerzer GK ，K naus P. BoneMorphogenetic Proteins：From Local to Systemic Therapeutics；article[J].BMP signaling is fine tuned on multiple levels.VoⅪ.hardcover ed：Birkha user，2008.

[3]Little SC ，Mullins MC. Bone morphogenetic protein heterodimers assemble heteromeric type I receptor complexes to pattern the dorsoventral axis[J].Nat Cell Biol，2009，11：637-633.

[4]Celeste Al， Song JJ， Cox K， et al[J].J Bone IVfiner Res， 1994，9（Suppl 1）：S13.

[5]Wrana J L. Regulation of Smad activity[J]. cell， 2000，100（2）： 189-192.

[6]Zhang F，QiuT Wu X ， et a1.Sustained BMP signaling in osteoblasts stimulates bone formation by promoting angiogenesis and osteoblast differentiation[J].J BoneMiner Res，2009，24：1224-1233.

[7]Inoue Y Imamura T. Fteguiation of TGF-beta family signaling by E3 ubiquitin ligases[J]. Cancer Sci，2008，99： 2107-2112.

[8]Massague J， Seoane J， Wotton D. Smad transcription factors[J].Genes Dev，2005，19：278-810.

[9]MoustakasA， Souchelnytskyi S， Heldin GH. Small regulation in TGF-psignaling transduction [J]. J Gell Sci， 2001，114（24）：4359-4369.

[10]Lai GF， Gheng S L. Signal transductions induced by bone morphogenetic protein-2 and transforming growth factor-beta in normal human osteoblastic cells[J].J Biol Chem，2002，277：15514-22.

[11]Grass erW A， Gr1ic I， Borovecki F， et al. BMP-6 exerts its osteoinductive effect through activation ofIF-I and EF pathways[J]. Inter }rthopae， 2007，31（6）：759-765.

[12]Kang Q， Sun MH， Cheng H， et al[J].Gene The，2004； 11（17）：1312-132.

[13]Song JJ， Celeste Al， Kong FM， et al[J].Endocrinology， 1995，136（10）：4293-429.

[14]Alden TD， Beres EJ， Laurent JS， et al[J].J Cranicfac Surg， 2000，11（1）：24-30.

[15]ChengH ，Ji angW ，P hilipsF M，et al [J].J Bone Joint SurgA m，2003，85（8）：1544-1552.

[16]Li JZ， Li H Sasaki T， et al. Gene Tier， 2003，10（20）：1735-174

[17]Abdelaal MM， Tbolpady SS， Kessler JD， et al[J].J Craniofac Surg，2004，15（5）：736-744.

[18]甘強，胡偵明.真核表達重組骨形態發生蛋白9的純化及生物骨誘導活性分析[J].生物醫學工程學雜志，2013，30（4）：822-827.

[19]江標，李明.人骨形成蛋白9基因修飾的兔骨髓間充質干細胞異位成骨實驗研究[J].四川大學學報（醫學版），2008，39（5）：723-727.

[20]Bessa PC， Cerqueira MT， Rada T， et al. Expression， purificationand osteogenic bioactivity of recombinant human BMP-4， -9， -10，-11 and -14[J].Protein Expr Purif，2009，63（2）：89-94.

[21]Miller AF，Harvey SA，Thies RS，et al. Bone morphogeneticprotein-9. An autocrine / paracine cytokine in the liver[J].J Biol Chem，2000，275（24）：17 937-17945.

[22]Lopez-Coviella I，Berse B，Thies RS，et al. Upregulationof acetylcholine synthesis by bone morphogenetic protein 9in a murine septal cell line[J].J Physiol Paris，2002，96（1-2）：53-59.

[23]Lopez-Coviella I，Berse B，Krauss R，et al. Induction andmaintenance of the neuronal cholinergic phenotype in thecentral nervous system by BMP-9[J].Science，2000，289（5477）：313-316.

[24]Ploemacher RE，Engels LJ，Mayer AE，et al. Bone morphogeneticprotein 9 is a potent synergistic factor for murinehemopoietic progenitor cell generation and colony formationin serum-free cultures[J].Leukemia，1999，13（3）：428.

編輯/肖慧