噬菌體展示技術的原理及在腫瘤治療中的應用

噬菌體展示技術最初是由美國 Missouri 大學的 Smith創建的，是一種噬菌體表面表達及篩選技術[1]。噬菌體展示技術的原理是以噬菌體為載體將外源蛋白的核酸片段克隆至噬菌體衣殼蛋白基因中，以融合蛋白的形式表達于噬菌體表面，用固定化的靶分子篩選與外源蛋白親和的噬菌體分子，不能結合的噬菌體被洗掉，而能結合的噬菌體被保留下來并通過感染大腸桿菌得以擴增、富集和篩選[2，3]。本文將概述噬菌體展示技術的基本原理與類型及其在腫瘤治療中的應用。

1 噬菌體展示技術的類型

1.1 絲狀噬菌體展示技術： 絲狀噬菌體展示是最早開發的噬菌體展示系統，技術最為成熟，蛋白質借助該系統展示需要經過細胞膜分泌，因此對于難以分泌的蛋白質較難展示，并且該噬菌體衣殼基因的 N 端融合外源蛋白質的容量也有限。絲狀噬菌體是單鏈環狀 DNA 病毒，其基因組為6.4 kb，共編碼10個不同的蛋白質。在絲狀噬菌體的10個蛋白質中，與表面展示有關的蛋白質主要是由基因Ⅲ（ g3） 和基因Ⅷ（ g8） 編碼的外殼蛋白gp3和gp8，分別構成 gp3和gp8 展示系統。gp3 和gp8 蛋白的N 端均游離在外，外源蛋白通過柔性接頭分別與其N端連接，融合蛋白即可展示外源蛋白的構象。gp3 和 gp8 展示系統的差別在于：①融合外源蛋白大小的能力不同。gp3 可融合較大的外源肽段，大至50kDa 的蛋白質已被成功展示，而 gp8 分子量較小，只能融合較小的外源肽，如五肽或六肽，攜帶肽段太大會影響外殼的組裝。②拷貝數不同，gp8的拷貝數極多，接近3000個，gp3的拷貝數僅3～5個，但可以減少多價結合，故可用于選擇高親和力的配體，制備人工疫苗則選擇 gp3 作為融合部位更為合適[4]。

1.2 λ噬菌體展示技術 λ噬菌體是最早使用的克隆載體，其兩端為不閉合的線形雙鏈 DNA，末端為長12個核苷酸的互補單鏈。λ噬菌體展示技術是將外源蛋白質與λ噬菌體的主要尾部蛋白PV或λ噬菌體頭部裝飾蛋白D融合而被展示的。與絲狀噬菌體比較而言，λ噬菌體表達蛋白是在宿主細胞內組裝后再釋放而不必通過分泌途徑，因此它對展示的肽或蛋白質的大小沒有限制。成熟的λ噬菌體顆粒有兩個結構單位，即頭部D蛋白區域和尾部PV蛋白區域組成，D蛋白是λ噬菌體頭部組裝必需的蛋白，其分子量為11 kDa，有405個拷貝 [5]。λ噬菌體的尾部蛋白PV為管狀結構，分子量為25.8 kDa，有192個拷貝。PV蛋白有兩個折疊區域其C端的折疊區域和D蛋白的N端區域可供外源序列插入或替換。這兩個基本展示位點均是多拷貝，而且適合展示低親和力和分子量較大的蛋白質分子，特別適合用于文庫的構建[6]。

1.3 T4 噬菌體展示技術 T4噬菌體展示技術是上世紀80代末期建立起來的一種展示技術。性質完全不同的外源蛋白質可展示與T4噬菌體的衣殼蛋白SOC的C端和HOC的N端，是一種雙展示系統，這兩種蛋白質不是T4噬菌體復制所必需的蛋白質，而且借助這兩個位點因與噬菌體顆粒的親和力高表達的蛋白不需要復雜的蛋白純化，因此避免了因純化而引起的蛋白質變性和丟失[7]。T4噬菌體展示的蛋白質常常是在宿主細胞內進行裝配，不需通過分泌途徑進行分泌，因而對展示的多肽或蛋白質的大小沒有太大的限制，其拷貝數高，在分析抗原表位、細胞因子、受體及生物工程學等方面有相當大的應用潛力[8]。但由于其采用的是C 端融合，這對研究蛋白質N 端的功能不適合，而使它在蛋白質生物研究中的應用受到局限[9，10]。

2 噬菌體展示技術的應用

噬菌體展示技術已廣泛應用于細胞信號傳導、基因表達調控、人源單克隆抗體的制備、藥物篩選和疫苗研制等研究領域，近年來其在腫瘤診斷和治療方面越來越發揮著重要作用[11～14]。

2.1 展示與熒光分子結合的腫瘤相關抗原肽，實現腫瘤組織可視化。通過噬菌體對與熒光分子結合的腫瘤相關蛋白的展示，可以在體實現對腫瘤發生全過程的可視化，為研究腫瘤的發生、發展提供新途徑。與過去應用放射性標記抗體來實現腫瘤的可視化相比，應用腫瘤相關抗原肽實現腫瘤的可視化抗原肽分子比抗體小因此的無免疫原性，更容易滲透到組織、更容易擴散、可視性效果更好[15～17]。Dickinson應用生物素將IAGLATPGWSHWLAL這種前列腺癌的相關的15個蛋白質寡肽進行標記并在熒光顯微鏡下成功的實現了前列腺癌的可視化[18]。Luna在應用CPIEDRPMC這個9個氨基酸的寡肽成功的實現了對HT29、CaCo-2、RKO、SW480和DLD-1五種腫瘤細胞在體腫瘤的可視化[19]。將腫瘤特異性抗原肽與熒光分子結合，不僅可研究腫瘤的發生、發展，由于其上鏈接有熒光分子在熒光顯微鏡下觀察到腫瘤組織的影像，還可以實現對腫瘤的在體診斷。Konkalmatt以胰腺癌細胞為靶細胞利用噬菌體展示庫篩選的特異性六肽，熒光顯微結腸鏡檢查發現經熒光索標記的六肽能與胰腺癌細胞特異性結合而不與正常組織結合，可用于胰腺癌的早期診斷[20]。

2.2 篩選腫瘤差異性抗原肽，用于靶向治療 通過噬菌體展示技術篩選出正常組織和腫瘤組織差異性抗原肽，從而在體外實現對腫瘤組織和癌癥組織的區分。腫瘤細胞表面表達相關的腫瘤抗原，通過噬菌體展示技術可以篩選出與這些抗原結合的配體表位肽，篩選出來的配體肽段與抗體相比特異性更強、親和力更大，而且這些配體肽段可在體外進行化學合成因此獲取的量可遠遠大于制備抗體的量。這些配體表位肽能夠與腫瘤抗原特異性的結合，因此其同抗體一樣與腫瘤抗原結合后可誘導腫瘤細胞凋亡及產生ADCC效應發揮其抗腫瘤的作用。目前通過噬菌體展示技術已經篩選出與HER neu、EGFR、Hepsin、Tie2 GRP78、CD21等配體表位肽。這些配體表位肽與腫瘤抗體相比突出特點是能夠避免被內皮系細胞吞噬，因此其在腫瘤靶向治療中將展示出廣闊的應用前景[21，22]。

2.3 篩選腫瘤治療性相關肽，抑制腫瘤生長 通過噬菌體展示技術可以篩選出在腫瘤生長過程發揮促進腫瘤生長的作用的蛋白質，例如促進血管生成的蛋白質、促進腫瘤發生和侵入的蛋白質，而抑制這些腫瘤發展過程對腫瘤生長有促進作用的蛋白質可以抑制腫瘤生長。Joshi報道NPNWGPR可以與腺癌組織特異結合，在體實驗證實其可實現抑制腫瘤生長[23]。通過噬菌體展示技術篩選的HTMYYHHYQHHL小肽可以結合激酶的受體，研究表明其可70%實現對移植乳腺癌腫瘤的抑制作用，53%抑制肺轉移[24]。Roth的研究顯示CGNKPTRGC小肽與腫瘤淋巴管結合抑制腫瘤生長[25]。

噬菌體展示技術已被廣泛應用于腫瘤抗原表位鑒定、腫瘤抗原抗體庫的建立、蛋白分子的相互識別、抗腫瘤藥物的研發與篩選、早期癌癥的分子影像學診斷和治療研究等方面，相信該技術將在腫瘤研究中發揮更重要。隨著生物學研究對腫瘤靶向蛋白配體的不斷探索，腫瘤靶向治療因其較低的不良反應及良好的療效，能夠明顯提高患者的生活質量，代表著腫瘤治療的未來趨勢，將來的腫瘤治療模式將是以分子生物學診斷為基礎的綜合性靶向治療。噬菌體展示肽庫技術在多種把向腫瘤多肽配體研究中發揮了重要作用，目前有研究報道：在體外已成功篩選出針對不同腫瘤細胞如肺癌細胞、大腸癌細胞、宮頸癌細胞、腎癌細胞以及急性髓性自血病細胞等特異性結合肽，這在腫瘤的診斷、靶向治療等方面具有潛在的臨床應用價值。

3展望

噬菌體展示技術是一項新近出現的分子生物學技術，該技術可以將不同的基因型和表現型有效地聯系起來，噬菌體展示技術目前已被廣泛應用于細胞信號傳導、基因表達調控、人源單克隆抗體的制備、藥物篩選和疫苗研制以及疾病的診斷和治療等研究領域。噬菌體展示技術必將成為后基因組時代的功能基因組學和蛋白組學研究的強有力工具。

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