冷凍保護(hù)劑HSPM與人精子的作用時(shí)間對(duì)其活力影響的研究

摘要：目的 探索人精子在冷凍前與冷凍保護(hù)液HSPM的最佳作用時(shí)間。方法 16位健康者的精液裝于16個(gè)冷凍瓶，按4個(gè)不同時(shí)間段（5、15、30、60min）共分四組進(jìn)行。結(jié)果 作用4個(gè)不同時(shí)間段后，平均精子活力指數(shù)分別為：（0.360±0.231），（0.298±0.201），（0.313±0.222）及（0.248±0.119），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論 30min是精子與HSPM的最佳作用時(shí)間；對(duì)于少精者的精子應(yīng)盡快冷凍。

關(guān)鍵詞：HSPM；精子；冷凍復(fù)蘇；精子活力

冷凍保存已廣泛用于生殖領(lǐng)域臨床，是人類生殖助孕技術(shù)的重要組成部分[1]。利用這項(xiàng)技術(shù)，長(zhǎng)期有效的保存生殖細(xì)胞，解決了男性不育的許多具體問題；但冷凍損害卻使人們的期望值打了折扣。精子冷凍復(fù)溫后的存活率僅僅為35%～60%，與體細(xì)胞冷凍復(fù)溫后的存活率可達(dá)90%相比較，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能令人滿意[2，3]。于是，如何使冷凍保存的精子復(fù)溫后的活力接近新鮮精液的活力，成了廣大輔助生殖技術(shù)研究者潛心研究的課題。本文通過(guò)冷凍前精子與冷凍保護(hù)液HSPM作用4個(gè)不同的時(shí)間后觀察精子活力的變化，了解HSPM冷凍保護(hù)液對(duì)精子活力的影響。

1 資料與方法

1.1精液標(biāo)本采集 隨機(jī)選取2013年6月～12月來(lái)自隨州市婦幼保健院的健康標(biāo)本16例。供精者年齡22～40歲，告知患者取精前禁欲2～7d，清洗雙手和外生殖器，采用手淫法取精。精液納入標(biāo)準(zhǔn)為：精液量≥2ml，精子密度≥70×106ml，精子活率（a+b）≥50%。

1.2試劑與儀器設(shè)備 精子冷凍保護(hù)液采用瑞典Nidacon公司生產(chǎn)的HSPM，含甘油、葡萄糖等成分。精液分析儀采用徐州廣科GK-9900A 型，液氮罐為 MVE xc47 /11-10；冰箱為松下BCD-1900WE；水浴箱為美國(guó)Lab-Line 生產(chǎn)。

1.3方法

1.3.1待標(biāo)本充分液化后，每份精液標(biāo)本分裝于16個(gè)1ml冷凍瓶，按4個(gè)不同時(shí)間段分別分四組進(jìn)行：5、15、30、60min。

1.3.2每個(gè)冷凍瓶加入1mlHSPM冷凍保護(hù)液及0.2ml精液充分混勻，在室溫（20℃～22℃）下放置不同時(shí)間，到時(shí)計(jì)算活力精子數(shù)。

1.4統(tǒng)計(jì)結(jié)果處理 所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)全部輸入微機(jī)，使用SPSS11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 HSPM作用前后及作用不同時(shí)間后的精子活力變化 充分液化后的新鮮精液與冷凍保護(hù)液HSPM作用4個(gè)不同時(shí)間段后，精子活力均有所下降，平均精子活力指數(shù)分別為：（0.360±0.231），（0.298±0.201），（0.313±0.222）及（0.248±0.119）。與新鮮精子的活力相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。其中15min和60min下降非常明顯，但30min后的精子活力又稍微有所回升。見表1。

2.2兩種冷凍方法對(duì)精子活力的影響 緩凍法復(fù)溫后的平均精子活力指數(shù)（0.181±0.134），高于速凍法的（0.141±0.105），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。兩種冷凍方法結(jié)果均顯示精子活力隨著冷凍時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。見表2。

3 結(jié)果分析

精子冷凍保存包括被冷凍保護(hù)劑孵育、降溫冷凍和超低溫儲(chǔ)存、水浴復(fù)溫等過(guò)程[4]。這些物理化學(xué)效應(yīng)直接作用于精子， 使其活力不可避免地受到一些影響。

為了盡量減少精子冷凍/復(fù)溫后的活力損失，Polge首先使用甘油作為冷凍保護(hù)劑，目前IVF實(shí)驗(yàn)室采用以甘油為主的復(fù)合型配方[5]。冷凍保護(hù)劑的作用機(jī)制非常復(fù)雜，保護(hù)效應(yīng)主要是與水分子形成氫鍵，改變水的正常晶體結(jié)構(gòu)，縮小了水分子體積，減少了凍結(jié)水的量。

甘油分子量大、滲透性高，能插入精子膜的雙層分子，誘導(dǎo)膜結(jié)構(gòu)變化。通過(guò)-OH基團(tuán)與水形成氫鍵，降低或阻止細(xì)胞內(nèi)冰晶形成，起到了膜內(nèi)保護(hù)劑的作用[6]。但甘油所具有的高滲透性，又很容易造成對(duì)精子的損傷。因?yàn)楦视湍軌蚋蓴_ATP合成與利用間的平衡，改變精子的生物能量狀態(tài)，依賴離子的細(xì)胞反應(yīng)過(guò)程的代謝控制會(huì)受到損害，發(fā)生不可逆的細(xì)胞損傷。因此，保護(hù)液中的甘油濃度是一個(gè)很重要的因素，當(dāng)甘油濃度過(guò)低時(shí)防護(hù)效果差；而濃度較高時(shí)又具有細(xì)胞毒性，影響精子活力[7]。

本文欲研究冷凍保護(hù)劑與精子的作用時(shí)間對(duì)其活力的影響，結(jié)果表明：作用后的精子平均活力指數(shù)均較新鮮精子降低，其中15min和60min下降明顯。原因可能是在作用的最初十幾分鐘內(nèi)，甘油對(duì)質(zhì)量不太好的精子具有較明顯的負(fù)面影響。作用至30min時(shí)，精子活力下降趨勢(shì)基本停止，甚至稍有回升，此時(shí)細(xì)胞的代謝活動(dòng)與保護(hù)液達(dá)到了新的平衡。作用至60min時(shí)，因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間與保護(hù)液接觸，甘油的高滲透性使精子膜受損，活力降低。實(shí)驗(yàn)表明HSPM保護(hù)液中的成分對(duì)精子活力有影響，精子與冷凍保存液的作用時(shí)間越長(zhǎng)，活力受影響越嚴(yán)重。因此對(duì)于少精者，精子與HSPM充分混勻后，應(yīng)加快冷存。而對(duì)于健康者的精子，30min是最好的作用時(shí)間。

復(fù)溫時(shí)水流至細(xì)胞內(nèi)造會(huì)成細(xì)胞膜破裂，此時(shí)的冰晶再形成又加重了冷凍時(shí)對(duì)細(xì)胞膜的損傷。所以，快速?gòu)?fù)溫對(duì)冷凍精液的活力影響較小。

4 結(jié)論

新鮮精子與冷凍保護(hù)液HSPM作用后，由于甘油的高滲透性，精子其活力均有所下降，作用時(shí)間越長(zhǎng)，活力下降越明顯。因此，冷凍少精者的精液，應(yīng)盡量縮短與冷凍保護(hù)液液的作用時(shí)間，將其搖勻后盡快進(jìn)行冷凍處理。30min是精子細(xì)胞代謝活動(dòng)與滲透作用達(dá)到平衡的階段，質(zhì)量好的精子活力達(dá)到最佳。對(duì)于健康者的精液，應(yīng)讓其與保護(hù)液作用30min再進(jìn)行冷凍處理。

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編輯/哈濤