穿心蓮內酯對血管性癡呆大鼠行為學及海馬區TrKA及Bcl—2表達的影響

摘要：目的 研究穿心蓮內酯對血管性癡呆大鼠的行為學改變及海馬區TrKA及Bcl-2表達的影響。方法 選取72只鼠齡為4個月的健康Wistar大鼠，實驗組大鼠采用雙側頸總動脈結扎方法建立血管性癡呆大鼠模型，并隨機選擇部分模型大鼠運用穿心蓮內酯進行治療，以Morris水迷宮檢測各組大鼠行為學的變化及運用免疫組化反復檢測大鼠額葉TrKA及Bcl-2的表達情況。結果 手術組與治療組大鼠的認知能力明顯低于對照組（P<0.01），治療組大鼠的認知能力較手術組有顯著提高（P<0.01）。大鼠額葉TrKA及Bcl-2陽性細胞數目均明顯高于對照組（P<0.01），且治療組大鼠的TrKA及Bcl-2陽性細胞數目較手術組高（P<0.01）。結論 缺血所致血管性癡呆大鼠的行為認知能力明顯下降，穿心蓮內酯可以通過調節TrKA及Bcl-2的表達抑制神經元細胞凋亡，從而對血管性癡呆大鼠行為能力具有改善作用。

關鍵詞：穿心蓮內酯；血管性癡呆；大鼠；TrKA；Bcl-2

血管性癡呆是因各種原因所指的腦血管疾病的基礎上出現獲得性認知功能障礙的一種綜合征[1]。TrKA及Bcl-2的表達情況可以預測損傷程度，對治療療效的評價也有價值。穿心蓮內酯可以拮抗腦缺血所致的血管性癡呆損傷效應，從而具有保護神經細胞的作用[2]。本研究以血管性癡呆大鼠模型為材料，探討穿心蓮內酯對血管性癡呆大鼠的行為學改變及海馬區TrKA及Bcl-2表達的影響。

1資料與方法

1.1一般資料 選取90只鼠齡為4個月的健康Wistar大鼠，雌雄一半，體重300g左右。所選取的大鼠首先經過Morris水迷宮測試已排除具有行為異常的大鼠。將72只大鼠隨機分為對照組、手術組和治療組各24只，每組大鼠的平均體重、雌性只數等一般情況差異無統計學意義（P>0.05）。

1.2方法 所有大鼠10%水合氯醛腹腔麻醉后行頸部正中切口，分離頸部雙側頸總動脈，于動脈近端和遠端進行結扎并離斷結扎中段，以保證完全阻斷頸總動脈血流。對照組大鼠同樣麻醉下頸部正中切口，分離進步雙側頸總動脈，但不進行結扎和離斷。治療組大鼠給予穿心蓮內酯，劑量200mg/Kg溶于2ml生理鹽水中，行灌胃給藥，1次/d。對照組和手術組大鼠1次/d 2ml生理鹽水灌胃。

血管性癡呆模型建立成功并各實驗組準備好后，3組大鼠分別于6h、1d、2d及7d行Morris水迷宮逃避潛伏期行為學測試。于上述各時間點每組大鼠隨機選取6只進行免疫組化實驗：大鼠常規麻醉后暴露心臟，左心室插管并打開右心房灌注生理鹽水，肝臟發白后灌注4%多聚甲醛，先快后慢。大鼠僵硬后取大鼠腦并浸置于4%多聚甲醛5h，取大鼠額葉腦組織并做4um切片，然后進行免疫組化染色。顯微鏡下觀察TrKA和Bcl-2蛋白陽性細胞數目。以每個視野為單位計數陽性細胞數目并多個視野求平均值為最終計數個數。

1.3統計學方法 將觀察記錄的數據錄入統計學分析軟件SPSS19.0進行統計學的處理與分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，以P>0.05為差異無統計學意義，P<0.05為差異具有統計學意義，P<0.01為差異具有顯著統計學意義。

2結果

通過水迷宮逃避潛伏期測試以評價各組大鼠認知能力，見表1。結果顯示，對照組大鼠的6h、1d、2d及7d的逃避潛伏期與手術組和治療組同期比較均較短，差異均存在顯著統計學意義（P<0.01），表明對照組大鼠的認知能力（記憶能力）較手術組和治療組都強。各組大鼠不同時間點額葉Bcl-2免疫組化檢測陽性細胞數比較分析見表2。結果顯示，手術組與治療組大鼠的腦額葉細胞中Bcl-2陽性細胞數目均明顯高于對照組，差異具有顯著統計學意義（P<0.01）。

各組大鼠不同時間點額葉TrKA免疫組化檢測陽性細胞數比較分析見表3。結果顯示手術組與治療組大鼠腦額葉細胞中TrKA陽性細胞數目明顯高于對照組，差異具有顯著統計學意義（P<0.01）。

3討論

腦缺血所導致的腦部功能疾病的具體機制十分復發，可能與腦缺血后神經元凋亡，能量代謝異常，興奮性氨基酸毒性，氧自由基損害等一系列因素有關[3]。結扎大鼠雙側頸總動脈可使大鼠腦缺血，長期供血不足情況下通過氧自由基途徑等可誘導海馬區神經元的凋亡。本研究中采用該方法均全部成功建立大鼠模型。

TrkA激活后能抑制軸突變性， 促使軸突生長，促進神經遞質合成進而改善腦缺血導致的神經網絡損傷。本研究結果也顯示，手術組大鼠的認知能力顯著低于對照組（P<0.01），但其TrKA及Bcl-2的表達均高于對照組（P<0.01）。穿心蓮內酯可以激活eNOS-NO/cyclic GMP信號傳導途徑，從灌注量方面改善腦部血流，營養腦部神經而改善腦缺血損傷。此外，穿心蓮內酯還可以抑制P13/Akt介導的氧化應激反應和下調IL-1β、NO等炎性介質而阻止或減輕腦缺血損傷。本實驗研究結果也顯示，治療組大鼠的認知能力較手術組有顯著改善（P<0.01），且可使TrKA及Bcl-2的表達增強。

參考文獻：

[1]APP17肽對血管性癡呆大鼠行為學及額葉Bcl-2，Bax蛋白表達的影響[J].中國實驗診斷學，2007，11（2）：174-176.

[2]Chan SJ，Wong WS，Wong PT.Cerebral ischaemia[J].Br J Pharmacol，2010，161（3）：668-679.

[3]楊杰，周芝文，鄭麗君，等.TrKA和Bcl-2在局灶性腦缺血再灌注大鼠大腦皮質中的表達[J].中風與神經疾病雜志，2010，27（7）：584-588.

編輯/申磊