5株鵝細小病毒分離鑒定及VP3基因遺傳進化分析

摘 要：從江蘇省各市鵝場死亡的、具有小鵝瘟典型病變的雛鵝肝、脾、腸病料組織中分離到5株病毒分離物。經過實驗室鑒定，該5株病毒分離能與小鵝瘟陽性血清發生沉淀反應，并均能使用針對小鵝瘟病毒VP3基因特異性引物擴增出與目的條帶大小一致的DNA片段。將PCR產物純化、連接、轉化、TA克隆等一系列實驗后將獲得陽性重組質粒送測序。另外，為了探究該病毒的遺傳進化方向，本研究同時對鵝細小病毒VP3基因進行了系統進化分析。

關鍵詞：鵝細小病毒；瓊脂擴散試驗；序列測定；遺傳進化

中圖分類號：S852.65 文獻標識碼：A 文章編號：1001-0769（2015）04-0066-03

鵝細小病毒病又稱小鵝瘟，其作為一種急性傳染病給養鵝業造成了重大的經濟損失，嚴重影響了養鵝業的健康發展。該病主要侵害1月齡以內的雛鵝，發病后主要表現為精神萎靡、食欲廢絕、嚴重下痢和滲出性腸炎等癥狀[1]。該病的病原為鵝細小病毒（Goose ParvoVirus， GPV），屬于細小病毒科，細小病毒屬；GPV僅有一個血清型[2]，病毒粒徑約20 nm，是目前已知的動物病毒中較小、較簡單的病毒之一[3]。我國學者方定一于1956年首次在江蘇揚州發現并命名為“小鵝瘟”[1]。匈牙利學者德舍氏（Derzsy’s）于1966年首次使用鵝胚分離到該病毒，1974年，世界家禽協會將其正式命名為Derzsy’s病，隨后GPV不斷蔓延至中國臺灣[4]、匈牙利[5，6]、英國[7]、日本[8]、泰國[9]、德國[10]、美國[11]、瑞典[12]和波蘭[13]等多個國家和地區，給全球養鵝業造成了嚴重危害。本研究從江蘇省各市鵝場病死雛鵝的肝、脾、腸病料中分離到5株病毒。通過實驗室診斷證明所分離的5株野外病毒均為小鵝瘟病毒，本研究中同時對該5株GPV的VP3基因進行序列測定并進行了系統的遺傳進化分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料

江蘇省各市鵝場死亡的、具有小鵝瘟典型病變的雛鵝肝、脾、腸病料組織，病料來源及分離時間見表1。

1.1.2 種胚

9～10日齡SPF胚購自北京梅里亞SPF種禽場；鵝胚購自高郵市非免種鵝場。

1.1.3 抗原與血清

GPV瓊擴標準抗原、陽性血清均由本研究中心制備。

1.1.4 試劑及儀器

Taq酶、RNA酶、氨芐青霉素、IPTG、X-gal、dNTP、DNA marker、pEASY-T3 Cloning Kit和膠回收試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；EDTA、Tris堿、SDS和蛋白酶K購自Sigma公司；EcoRⅠ限制性內切酶購自Fermentas公司；其他試劑均為國產分析純級；PCR擴增儀為美國ABI公司產品，型號為GeneAmp PCR System 9700；高速冷凍離心機為美國Sigma公司產品，型號為3K15；小鵝瘟病毒VP3基因的特異性引物：P1：5’-CCAAGCTACAACAACCACAT-3’和P2：5’-TGAGCGAACATGCTATGGAAGG-3’，目的條帶大小為539 bp。

1.2 方法

1.2.1 病毒分離及傳代

取具有典型病變鵝的肝、脾、腸組織，剪碎，按1∶3加入滅菌PBS溶液，研磨，勻漿，經超聲波處理后， 5 000 r/min離心15 min，反復凍融數次，取上清液加青、鏈霉素雙抗至2 000 U/mL和2 mg/mL，接種非免疫鵝胚，0.2 mL/枚，置38 ℃孵育。收取72 h后死亡鵝胚的尿囊液，分裝成若干青霉素小瓶，每瓶1 mL～2 mL，-70 ℃冷凍保存備用。每代設不接種的正常鵝胚作對照。傳代時尿囊液均作1∶100稀釋，分別接種6～8枚鵝胚，每胚0.2 mL，取72 h～120 h之間死亡的鵝胚尿囊液。

1.2.2 雞胚接種試驗

用上述無菌收集的尿囊液在雞胚上盲傳3代，接種10日齡的雞胚，每胚尿囊腔接種0.2 mL，置37 ℃溫箱孵育。24 h觀察，剔除死胚，繼續孵化。以后每天照胚2次，收取孵化過程中死亡的胚，以及接種120 h后仍未死亡的胚的尿囊液。

1.2.3 瓊脂擴散試驗（AGP）

按照參考文獻所述的方法進行抗原純化濃縮，取死亡胚尿囊液，經6 000 r/min離心20 min棄沉淀，加等量氯仿混合，6 000 r/min離心30 min取上清，經PEG6000棄沉淀濃縮20倍后制成待檢抗原[14]。參照《獸醫微生物實驗指導》中的方法進行瓊脂擴散試驗[15]。簡述之，在瓊擴板周圍孔加入不同稀釋度的標準抗小鵝瘟病毒陽性血清，中心孔依次加入標準抗原、待檢病毒分離物和正常鵝胚尿囊液。

1.2.4 紅細胞凝集試驗

根據前述方法將病毒液進行純化后濃縮2倍制備待檢病毒液。將待檢病毒液用磷酸鹽緩沖液在“U”型板中進行2倍連續倍比稀釋，每孔25 μL，最后1孔加相同體積的磷酸鹽緩沖液作對照。隨即向各孔內加入25 μL的1 %各種動物的紅細胞，充分混勻，37 ℃放置15 min后檢查結果。

1.2.5 病毒基因組提取

按照參考文獻[4]所述的方法提取GPV各分離株的基因組，簡述之：500 μL尿囊液與裂解緩沖液（含有pH8.0的50 mM的Tris，5 mM EDTA， 2 % SDS和200 μg/mL的蛋白酶K）等體積的混合，完全混勻后使用等體積的酚氯仿（苯酚∶氯仿=1∶1）抽提兩次，12 000 r/min離心10 min后吸取上清使用兩倍體積的無水乙醇進行沉淀，-20 ℃放置10 min后12 000 r/min離心10 min后棄上清，使用70 %的酒精溶液清洗沉淀后TE緩沖液溶解，-20 ℃保存備用。

1.2.6 鵝細小病毒VP3基因的擴增及序列測定

以提取的基因組DNA為模板、P1、P2為引物擴增VP3基因片段。反應條件如下：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s， 55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環；最后進行72 ℃延伸5 min。PCR產物經1 %瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。目的DNA片段與TA克隆載體相連后，經轉化、挑斑、搖菌、質粒提取及鑒定后，將含有重組質粒的陽性克隆斑送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

1.2.7 小鵝瘟病毒VP3基因遺傳進化分析

將測序結果進行BLAST搜索后，下載并整理了107株小鵝瘟病毒及19番鴨細小病毒VP3基因的序列數據。使用Lasergene7.1軟件包中的Meaglin軟件進行比對，然后使用BioEdit軟件進行序列整理，最后對比對后的序列進行遺傳進化分析。遺傳進化樹利用MEGA 6.0軟件中的最大似然法進行構建，軟件預測最佳替換模式為K2+G。

2 結果

2.1 病毒分離

鵝胚接種后，多數胚死亡時間在60 h～120 h之間，未接種的對照鵝胚均健康存活。與對照鵝胚相比，感染胚可見絨毛尿囊膜增厚，胚胎發育阻滯，胚體全身嚴重出血，胚頭充血嚴重（圖1）；多數胚胎的心、肝、腎有出血，少數胚胎的心肌蒼白。

2.2 雞胚接種試驗結果

10日齡雞胚接種病毒后，未發生死亡現象，雞胚血管鮮紅，卵黃呈金黃色，尿囊液清澈，胚體發育良好，剖檢后無任何病理變化。

2.3 瓊脂擴散試驗（AGP）結果

瓊脂擴散試驗結果表明，用死亡鵝胚尿囊液制備的病毒濃縮抗原能與GPV陽性血清發生沉淀反應，并與小鵝瘟診斷抗原和陽性血清形成的沉淀線吻合，結果見圖2。

2.4 紅細胞凝集試驗結果

所有5株病毒分離物均不凝集雞、鴨、鵝、豚鼠及兔子的紅細胞。

2.5 PCR鑒定結果

GPV各分離株VP3基因擴增產物經1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，均可見約539 bp的目的條帶，DNA大小與預期的結果相符（圖3），結果表明這5株病毒分離物中均有GPV。經雞胚接種實驗、瓊脂糖擴散實驗及PCR檢測實驗充分證實了這5株病毒分離物均為GPV，并將1～5號病毒分離物分別命名為Goose parvovirus/nanjing/09、Goose parvovirus/taizhou/12、Goose parvovirus/nantong/12、Goose parvovirus/yangzhou/08、Goose parvovirus/yangzhou/11。

2.6 小鵝瘟VP3基因遺傳進化分析結果

使用MEGA5.0遺傳進化分析軟件構建的ML進化樹見圖4，從遺傳進化樹來看，GPV與MDPV分布在不同的兩個分支，這符合該病毒屬一般規律[16， 17]。而GPV又進一步演化為3個分支。本研究中5株GPV分離株中有4株處于國內主要分支上，僅有1株（Goose parvovirus/yangzhou/11）與當前市售活疫苗在同一分支。該結果表明隨著GPV病毒在野外的不斷遺傳變異，該病毒在不斷的進化演變，從而出現了較新的基因型。

3 討論

本研究通過分離及鑒定獲得了5株GPV野外分離株，并對這5株GPV進行了系統遺傳進化分析。實驗結果表明國內主要分支已逐漸形成了新的基因亞型，并且與臺灣的主要分離株具有較近的親緣關系。但臺灣因其與大陸相分離的特點，也逐漸出現了與內陸不同基因型的分支，其與波蘭、美國、匈牙利、德國、英國及法國形成了國外分支。市售活疫苗為1961年從中國大陸分離到的野毒經多次傳代致弱而來，但從當前病毒分離及遺傳進化分析結果來看，該分支已逐漸淡去其主要流行的特點，本研究中于2011年分離到的一株病毒是該分支最晚分離到，其他市售疫苗分支上的分離株的分離年代均較久遠。根據基因型越相近其免疫保護效果越確實的一般規律[18]，我們分析認為如果使用國內主要分支上的流行株作為疫苗侯選株進行疫苗的開發，更具有生物學意義。

參考文獻：（18篇，略）