血凝與血凝抑制試驗(yàn)

高 波

（瓦房店市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧?瓦房店?116300）

HA是血凝試驗(yàn)，HI是血凝抑制試驗(yàn)。HI試驗(yàn)廣泛應(yīng)用于各大養(yǎng)殖禽基地檢測(cè)禽流感病毒各亞型抗體。做好此試驗(yàn)對(duì)提高養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)、增加經(jīng)濟(jì)效益有決定性的作用。2022年7月20日，接到盲樣比對(duì)任務(wù)，共6份樣品，試驗(yàn)具體操作步驟如下。

1 PPS的制作

PPS磷酸鹽緩沖劑一袋加入兩升的純化水，之后制好待用，pH7.2。

2 紅細(xì)胞的配制

采集單位內(nèi)4只無禽流感和新城疫等抗體的健康公雞血液與等體積阿氏液混合均勻，用pH7.2，0.01摩爾/升的PPS洗滌，每次用2000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取出后用吸管吸出上清液棄去，再加入工作用PPS，這樣洗滌3次，最后一次吸出上清液后要把紅細(xì)胞表面的少量白細(xì)胞吸出棄掉。洗滌后用一毫升的紅細(xì)胞配99毫升的PPS配制成工作用的紅細(xì)胞懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3 血凝HA試驗(yàn)操作方法

在90℃微量反應(yīng)板中，每孔加入0.025毫升PPS。

第一孔加入0.025毫升抗原依次做0.025毫升的對(duì)被稀釋至第11孔。

每孔加入0.025毫升PPS。

每孔加入0.025毫升紅細(xì)胞懸液。

將反應(yīng)板在振蕩器上振蕩1～2分鐘，混合反應(yīng)物在室溫23℃靜置30分鐘后，觀察結(jié)果。

將反應(yīng)板傾斜60°觀察紅細(xì)胞流淌狀態(tài)，完全無眼淚樣流淌的最高稀釋倍數(shù)為血凝效價(jià)。最終測(cè)得抗原效價(jià)為1∶512。

4 HI試驗(yàn)

根據(jù)已經(jīng)測(cè)出的HA效價(jià)1∶512來配制4單位抗原。512除以4即是4單位抗原的稀釋倍數(shù)1∶128。

1.反應(yīng)板中1～8排的1～11孔加入配制好的0.025毫升PPS，12孔加入0.05毫升PPS。

2.在一次性90°微型微量反應(yīng)板第一孔加入0.025毫升待檢血清，用排槍充分吹打后吸0.025毫升于第二孔依次對(duì)倍稀釋至第10孔，再從第10孔吸取0.025毫升棄去。

3.在第7排的第1孔加入陰性血清倍比稀釋至第4列。

4.在第8排的第1孔加入陽性血清倍比稀釋至第10列。

5.反應(yīng)板的1～11孔全部加入0.025毫升的4單位工作抗原，23℃靜置30分鐘。

6.反應(yīng)板的各孔加入0.025毫升已經(jīng)配制好的雞紅細(xì)胞懸液，輕輕混勻加入后靜置40分鐘，40分鐘后判定結(jié)果。最終測(cè)得6份樣品，效價(jià)見表1。

表1 H5亞型病毒抗體檢測(cè)結(jié)果

5 注意事項(xiàng)

第一，要嚴(yán)格控制試驗(yàn)條件。紅細(xì)胞配制的濃度和抗原配制的濃度直接影響結(jié)果，還要嚴(yán)格把控試驗(yàn)溫度和試驗(yàn)的作用時(shí)間。

第二，用pH7.2的PPS作為稀釋液。

第三，試劑有沉淀或污染，不能使用。

第四，配制的4單位抗原配好后應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)用完。

第五，抗原開封溶解后放置在-15℃冷凍保存。

第六，從冰箱里取出恢復(fù)至室溫后使用兩小時(shí)左右。一周后，上級(jí)部門反饋結(jié)果完全正確。

綜上所述，要想做好此試驗(yàn)，必須按照操作規(guī)程，牢記注意事項(xiàng)，一定能成功。