探究α-淀粉酶高溫變性復性的實驗

一、提出問題

酶蛋白的化學本質是蛋白質，在過酸、過堿或溫度過高條件下，會使酶蛋白的空間結構遭到破壞，使酶失去活性。當酶蛋白處于最適溫度和徹底變性的臨界溫度之間的溫度時，酶的活性會降低，如果再讓酶蛋白恢復到適宜的溫度時，酶的活性將會如何變化呢？

二、提出假設

酶蛋白的變性主要是高級結構即酶的空間結構發生的改變，即主要是氫鍵、離子鍵、二硫鍵等次級鍵被破壞，致使肽鏈松散，變為無規則卷曲狀，從而失去活性。因為酶蛋白變性時，其一級結構即氨基酸的排列順序不變，據此推測，如果使酶蛋白變性的條件不是過于劇烈時，再讓其處于適當條件下，酶蛋白的活性還可以部分甚至全部恢復功能。

三、實驗驗證

α-淀粉酶的高溫復性

1.所選α-淀粉酶作用溫度范圍60~90℃，最適宜作用溫度為60~70℃，作用pH范圍5.5~7.0，最適pH為6.0。

2.實驗步驟：

注：“+”表示有；“-”表示無；“+”的多少代表顏色的深淺。冷卻后放置2.5個小時后，E組第10號中淀粉也分解完全。

四、結論

α-淀粉酶在100℃及以下的溫度中的變性，可以在適宜的溫度下恢復活性。

五、知識拓展

1.酶蛋白的變性

酶蛋白的活性部位分為結合部位和催化部位，前者負責與底物結合，決定酶的專一性，后者負責催化底物鍵的斷裂以及催化新鍵形成，決定酶的催化能力。酶的活性部位是一個三維實體，是由酶蛋白的一級結構所決定并且在一定的外界條件下形成的?；钚圆课坏陌被釟埢谝患壗Y構上可能相距很遠，甚至位于不同的肽鏈上，通過肽鏈的盤繞、折疊而在空間結構上相互靠近?？梢哉f沒有酶蛋白的空間結構就沒有酶蛋白的活性部位，即沒有酶蛋白的活性。

當酶蛋白受物理或化學因素的影響時，其空間結構遭到破壞，致使其理化性質和生物功能發生改變，但并不導致一級結構的改變，這種現象稱為酶的變性。酶蛋白變性后分子性質發生改變，如黏度升高，溶解度降低，結晶能力喪失，旋光度和紅外、紫外光譜均發生變化。

2.使酶蛋白變性的因素

能使酶蛋白變性的因素很多，如強酸、強堿、重金屬鹽、尿素、胍、去污劑、三氯乙酸、有機溶劑、高溫、射線、超聲波、劇烈振蕩或攪拌等。但不同種類的酶蛋白對各種因素的敏感性不同。

3.酶蛋白的復性

因為酶蛋白的變性主要是高級結構的改變，而其一級結構并不改變。因此，如果其變性條件不是過于劇烈，那么在適當條件下還可以恢復功能。例如胃蛋白酶加熱至80℃～90℃時，失去溶解性，也無消化蛋白質的能力，如果將溫度再降低到37℃，則又可恢復溶解性和消化蛋白質的能力。再如核糖核酸酶，該酶中所含四對二硫鍵及其氫鍵，它在β-巰基乙醇和8M尿素作用下，發生變性，失去生物學活性，但是變性后如經過透析去除尿素，β-巰基乙醇，并設法使巰基氧化成二硫鍵，酶蛋白又可恢復其原來的構象，生物學活性也幾乎全部恢復。根據蛋白質結構與變性程度和復性條件不同，復性會有不同結果。有時可以完全復性，恢復所有活力；有時大部分復性，但保留異常區；有些蛋白結構復雜，有多種折疊途徑，若無適當方法，會生成混合物。當然隨著變性時間的增加，條件的加劇、變性程度也會加深，就會達到不可逆的變性。

4.溫度對酶活性的影響

多數酶在60℃以上開始變性，熱變性通常是不可逆的，少數酶在pH為6以下變性時不發生二硫鍵交換，仍可在適宜條件下復性，如α-淀粉酶、胃蛋白酶等。多數酶在低溫下穩定，但有些酶在低溫下會鈍化，其中有些酶的鈍化是不可逆的。如固氮酶的鐵蛋白在0~1℃下15小時就會失活。

溫度對酶促反應速率的影響表現在兩個方面。一方面是當溫度升高時，與一般的化學反應一樣，反應速率加快，一般而言反應溫度每提高100℃，其反應速率即為原來反應速率的2倍。另一方面由于酶是蛋白質，隨溫度升高，酶蛋白會逐漸變性而失活，進而引起酶促反應速率的下降，酶蛋白所表現的最適催化溫度是這兩種影響的綜合結果。也就是說，在酶促反應的最初階段，酶蛋白的變性尚未表現出來，因此反應速率隨溫度升高而增加，但高于最適溫度時，酶蛋白變性逐漸突出，反應速率隨溫度升高的效應將逐漸為酶蛋白變性效應所抵消，反應速率迅速下降，因此表現為最適溫度。

最適溫度不是酶的特征物理常數，常受到其他條件如底物種類、作用時間、pH和離子強度等因素影響而改變。由于溫度使酶蛋白的變性是時間累加的，一般來講，反應時間長，酶的最適溫度低，反應時間短，則最適溫度就高。因此只有在規定的反應時間內才可確定酶的最適溫度。

作者單位：江蘇省運河中學