西瓜枯萎病菌T—DNA插入轉(zhuǎn)化子庫的構(gòu)建及其質(zhì)量評價

裴月令　曾凡云　彭軍　龍海波　郭建榮

摘 要 為研究西瓜枯萎病菌的致病分子機(jī)理，開展了病原菌的轉(zhuǎn)化子庫構(gòu)建工作。采用攜帶潮霉素抗性pTFCM雙元載體的農(nóng)桿菌AGL-1介導(dǎo)的ATMT轉(zhuǎn)化方法，獲得菌株FON-01的轉(zhuǎn)化子，通過表型觀察篩選突變體。結(jié)果表明：當(dāng)乙酰丁香酮（AS）濃度為200 μmol/L、農(nóng)桿菌OD600為0.4、分生孢子濃度為1×106個/mL時，于28 ℃共培養(yǎng)48 h轉(zhuǎn)化效率高達(dá)（663.33±24.95）個/106個孢子。構(gòu)建了總數(shù)為3 832個的轉(zhuǎn)化子庫并對其進(jìn)行了質(zhì)量評價，從2 201個轉(zhuǎn)化子中篩選出菌落形態(tài)、生長速度及產(chǎn)孢量等方面有所變異的突變體73個。病原菌轉(zhuǎn)化子庫的構(gòu)建為進(jìn)一步開展致病分子機(jī)理及相關(guān)基因克隆等方面研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 西瓜枯萎病菌；ATMT；轉(zhuǎn)化子庫

中圖分類號 S432.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Generation of a Transformant Library of Fusarium oxysporum.

f. sp. niveum by ATMT and Its Quality Assessment

PEI Yueling，ZENG Fanyun，PENG Jun，LONG Haibo，GUO Jianrong﹡

Environment and Plant Protection Institute，CATAS/Key Laboratory of Integrated Pest Management on

Tropical Crops，Ministry of Agriculture/Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical

Agricultural Pests，Haikou，Hainan 571101， China

Abstract In order to study the pathogenic molecular mechanism of Fusarium oxysporum. f. sp. Niveum，the transformant library was conducted. Agrobacterium strainAGL-1 containing the binary vector pTFCM was used for the transformation of strain FON-01，and the mutants were screened by penotype observation. Transformation efficiency was（663.33±24.95），when the acetosyringone concentration was 200 μmol/L，OD600 of AGL-1 was 0.4，conidia concehntration was 106/mL，co-culture time was 48 h and co-culture temperature was 28 ℃. 3 832 transformants were obtained and quality assessment to the library was finished. 73 mutants with variation of colony shape，growth speed and sporulation ability were screened from 2 201 transformants. The construction of transformants library would provide the foundation for further study of pathogenic molecular mechanism and related genescloning.

Key words Fusarium oxysporum. f. sp. niveum；ATMT；Transformant library

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.01.013

西瓜[Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum & Nakai]是中國重要的水果之一，在中國農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。中國是西瓜生產(chǎn)和消費大國，種植面積和產(chǎn)量均占世界一半以上（FAO）。與其它瓜菜類作物相比，種植西瓜的經(jīng)濟(jì)效益非常高，已經(jīng)成為增加農(nóng)戶經(jīng)濟(jì)收入的重要途徑。由尖孢鐮刀菌西瓜專化型[Fusarium oxyxporum Schl. f. sp. niveum（E. F. Smith）Snyder et Hansen]引起的西瓜枯萎病是一種世界性土傳病害，是中國西瓜種植業(yè)中的重要病害，生產(chǎn)上防治困難，可造成30%以上的產(chǎn)量損失[1]。

隨著農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，中國的西瓜種植業(yè)也呈現(xiàn)設(shè)施化、基地化、專業(yè)化的發(fā)展趨勢，重茬現(xiàn)象非常普遍，為西瓜枯萎病的發(fā)生、發(fā)展和流行創(chuàng)造了極為有利的條件，導(dǎo)致該病嚴(yán)重發(fā)生。近年來，該病在中國各個西瓜種植區(qū)均有發(fā)生，一般病株率10%～20%，重者達(dá)80%～90%[2]，已經(jīng)成為制約西瓜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素之一。目前有關(guān)該病病原菌致病分子機(jī)理方面的研究還很少，嚴(yán)重制約了相關(guān)防控工作的進(jìn)展。

國內(nèi)鄭肖蘭等[3]和梁慎等[4]開展了病原菌轉(zhuǎn)化方法的探索工作，獲得了部分轉(zhuǎn)化子，但缺少轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化和相應(yīng)的分子鑒定等工作。國外還未見有關(guān)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)該菌遺傳轉(zhuǎn)化的報道。本研究對根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA的轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了西瓜枯萎病菌1號小種的轉(zhuǎn)化子庫，并對其進(jìn)行質(zhì)量評價和突變體篩選工作，為進(jìn)一步克隆致病相關(guān)基因和致病分子機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 西瓜枯萎病菌1號小種菌株FON-01由國家蔬菜工程技術(shù)研究中心許勇研究員惠贈。攜帶雙元載體pTFCM（Kanr，含PtrpC：：hphB）的農(nóng)桿菌AGL-1由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)姜道宏教授惠贈。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 PDA和LB培養(yǎng)基分別用于培養(yǎng)西瓜枯萎病菌和AGL-1，配方參照《植病研究方法》[5]。MM和IM培養(yǎng)基均用于培養(yǎng)AGL-1，配方參照蔡志英等[6]。

乙酰丁香酮（AS）、2（N-馬啉）乙基磺酸（MES）、頭孢霉素、硫酸鏈霉素、利福平、卡那霉素等產(chǎn)品均購自Sigma公司；潮霉素B購自Roche公司；DNA片段膠回收試劑盒、pMD18-T載體和隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒購買自寶生物工程（大連）有限公司；Taq酶和dNTPs購買自天根生化科技（北京）有限公司；引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 FON-01轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化 菌株對抗生素的敏感性測定：將FON-01分別接種于含有不同濃度潮霉素的PDA平板上，觀察其生長情況并評價其敏感性。

FON-01分生孢子液的制備：將菌株接種于液體PDA培養(yǎng)基上，以180 r/min、28 ℃培養(yǎng)5 d，用IM液體培養(yǎng)基調(diào)至所需濃度。

FON-01的轉(zhuǎn)化： （1）將AGL-1（攜帶pTFCM）菌株在LB培養(yǎng)基平板（含50 mg/L利福平，50 mg/L卡那霉素）上劃線，于28 ℃培養(yǎng)2 d。（2）挑取單菌落接種于10 mL MM培養(yǎng)基（含50 mg/L卡那霉素）上，以180 r/min，28 ℃培養(yǎng)2 d。（3）離心收集菌體，用IM培養(yǎng)基（含適量 AS）以 180 r/min、28 ℃培養(yǎng)5～6 h，用IM培養(yǎng)基將菌液OD600稀釋至所需濃度，與FON-01孢子液按照1 ∶ 1（V ∶V）比例混合。（4）取0.2 mL混合液涂布于鋪有硝酸纖維素膜的IM 平板上（含200 μmol/L的AS，直徑9 cm），避光共培養(yǎng)后，用滅菌的手術(shù)刀將硝酸纖維濾膜切成寬度約為5 mm的條帶，分別反鋪于2個PDA平板上（含250 mg/L潮霉素、250 mg/L頭孢霉素），于28 ℃培養(yǎng)5 d后將濾膜邊緣的單菌落轉(zhuǎn)接到PDA平板上（含250 mg/L潮霉素）進(jìn)行復(fù)篩并保存，統(tǒng)計各處理轉(zhuǎn)化子數(shù)并計算轉(zhuǎn)化效率。其中AS濃度設(shè)為50、100、150、200、250、300、350 μmol/L，AGL-1（pTFCM）OD600值設(shè)為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0，F(xiàn)ON-01孢子液濃度設(shè)為1×104、1×105、1×106、1×107、1×108個/mL，共培養(yǎng)時間和溫度分別設(shè)為24、36、48、60、72 h和16、24、26、28、30、32 ℃等。每處理5個平板，重復(fù)3次，計算平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，并用SAS9.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析[7]。

1.2.2 FON-01轉(zhuǎn)化子庫的構(gòu)建和質(zhì)量評價 參照1.2.1中優(yōu)化后的轉(zhuǎn)化條件，進(jìn)行轉(zhuǎn)化子庫的構(gòu)建并對其進(jìn)行質(zhì)量評價。遺傳穩(wěn)定性評價：隨機(jī)選取20個轉(zhuǎn)化子接種于PDA平板，以28 ℃培養(yǎng)5 d后在菌落邊緣挑取少量菌絲接種到一個新的PDA平板上，轉(zhuǎn)接10次后接種到含250 mg/L潮霉素的PDA平板上，觀察菌落生長情況。

PCR擴(kuò)增：根據(jù)載體pTFCM潮霉素抗性基因編碼區(qū)設(shè)計引物Hygst1（5′-TGAACTCACCGCGACGT

CTGT-3′）和Hygst2（5′-ACGGTGTCGTCCATCACAGT

-3′），2引物之間長度為498 nt。參照Xu等[8]的方法提取FON-01和20個轉(zhuǎn)化子基因組DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以無菌水為對照，將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆后進(jìn)行測序驗證。

Southern雜交驗證：隨機(jī)選取14個轉(zhuǎn)化子，提取基因組DNA后，選用在載體pTFCM上沒有識別位點的ApaⅠ進(jìn)行充分酶切。以AGL-1（攜帶pTFCM）菌液為模板，用引物Hygst1和Hygst2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將產(chǎn)物回收、定量后參照曾凡云[9]的方法按照試劑盒說明書進(jìn)行探針標(biāo)記和Southern印跡雜交。

1.2.3 突變體的篩選 將FON-01和轉(zhuǎn)化子分別接種于PDA平板中央（直徑9 cm），于28 ℃培養(yǎng)7 d后觀察菌落形態(tài)，采用十字交叉法測量菌落直徑。待菌落長滿整個PDA平板（直徑9 cm）時，用10 mL無菌水將菌落表面的分生孢子洗下，鏡檢計數(shù)。每個轉(zhuǎn)化子5個平板，重復(fù)3次并進(jìn)行SAS分析[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 FON-01轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

培養(yǎng)結(jié)果表明，當(dāng)潮霉素濃度在250 mg/L以上時，菌株FON-01的生長完全受到抑制，因此在建庫時用含有該濃度潮霉素的PDA平板進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的篩選。

經(jīng)過多次轉(zhuǎn)化試驗，發(fā)現(xiàn)用AS預(yù)處理AGL-1（攜帶pTFCM）時，當(dāng)AS濃度在50 μmol/L時僅出現(xiàn)個別單菌落，AS濃度越高轉(zhuǎn)化效率越高。當(dāng)AS濃度為200 μmol/L時，轉(zhuǎn)化效率為（620.67±20.98）個/106個孢子，平均每個平板上出現(xiàn)31.04個轉(zhuǎn)化子（圖1-A）。由于高濃度的AS會增加T-DNA片段插入的拷貝數(shù)，另外轉(zhuǎn)化效率太高不利于生長缺陷突變體的挑取，因此選用200 μmol/L的AS進(jìn)行轉(zhuǎn)化。進(jìn)一步的研究表明，AS濃度為200 μmol/L、農(nóng)桿菌OD600為0.4、分生孢子濃度為1×106 個/mL時，于28 ℃共培養(yǎng)48 h轉(zhuǎn)化效率最高，為（663.33±24.95）個/106個孢子（圖1B-E）。

2.2 FON-01轉(zhuǎn)化子庫的構(gòu)建和質(zhì)量評價

參照2.1中轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行轉(zhuǎn)化子庫的構(gòu)建，目前已獲得3 832個轉(zhuǎn)化子。

2.2.1 遺傳穩(wěn)定性評價 選取的20個轉(zhuǎn)化子在不含潮霉素的PDA 平板上轉(zhuǎn)接10次后再轉(zhuǎn)接到含潮霉素的PDA 平板，均能正常生長，其菌落形態(tài)與初始培養(yǎng)物無明顯差別，表明轉(zhuǎn)化子所攜帶的外源片段能夠穩(wěn)定遺傳。

2.2.2 PCR擴(kuò)增 以FON-01和轉(zhuǎn)化子的基因組DNA為模板，用引物Hygst1和Hygst2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果20個轉(zhuǎn)化子均獲得約0.5 kb的擴(kuò)增產(chǎn)物（圖2）。隨機(jī)選取轉(zhuǎn)化子Fat38、Fat188和Fat648的擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行回收、克隆后測序， 結(jié)果表明其和潮霉素抗性基因編碼區(qū)序列完全一致。

2.2.3 Southern雜交驗證 隨機(jī)選取14個轉(zhuǎn)化子進(jìn)行southern雜交，結(jié)果轉(zhuǎn)化子Fat38、Fat188、Fat648、Fat1420、 Fat1937、Fat2678、Fat2816和Fat3131均有1條信號帶，轉(zhuǎn)化子Fat849、Fat1287、Fat2897和Fat3428均有2條信號帶，而Fat1348和Fat1672分別有3條和4條信號帶（圖3）。

2.3 突變體的篩選

通過菌落形態(tài)觀察和產(chǎn)孢量統(tǒng)計，從2 201個轉(zhuǎn)化子中初步篩選出菌落形態(tài)、生長速度及產(chǎn)孢量等方面有所變異的突變體73個，其中菌落形態(tài)、生長速度和產(chǎn)孢量均變異的有8個，菌落形態(tài)和生長速度變異的有1個，生長速度和產(chǎn)孢量變異的有41個，僅菌落形態(tài)變異的有3個，僅生長速度變異的有9個，僅產(chǎn)孢量變異的有11個（表1和圖4）。

3 討論與結(jié)論

本研究利用攜帶雙元載體pTFCM的農(nóng)桿菌菌株AGL-1介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法構(gòu)建了總數(shù)為3 832個的西瓜枯萎病菌轉(zhuǎn)化子庫并對其進(jìn)行了質(zhì)量評價。從14個轉(zhuǎn)化子的Southern雜交結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中8個轉(zhuǎn)化子只有一條信號帶，估算單位點插入轉(zhuǎn)化子比例約為57.14%。在對2 201個轉(zhuǎn)化子的初步篩選中獲得了在菌落形態(tài)、生長速度及產(chǎn)孢量等方面有所變異的突變體73個。該病原菌轉(zhuǎn)化子庫的構(gòu)建及部分突變體的獲得，為進(jìn)一步開展致病分子機(jī)理和相關(guān)基因克隆等研究奠定基礎(chǔ)。

通過基因插入失活獲得覆蓋整個基因組的轉(zhuǎn)化子庫，從中篩選表型變異突變體，并利用外源插入片段作標(biāo)記進(jìn)行目的基因的克隆是當(dāng)前功能基因組學(xué)研究的常用策略。限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的REMI和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的ATMT是最常用的絲狀真菌轉(zhuǎn)化技術(shù)。和REMI技術(shù)相比，ATMT具有轉(zhuǎn)化材料易得[10]、效率高[11-12]、外源片段插入比例高且多為單位點[13]以及轉(zhuǎn)化子遺傳穩(wěn)定等優(yōu)勢[14-15]。1995年，Bundock等[16]首次采用該技術(shù)完成釀酒酵母的轉(zhuǎn)化，隨后該技術(shù)在曲霉[17]、稻瘟菌[18]、炭疽菌[19]等真菌轉(zhuǎn)化中得到廣泛應(yīng)用。本研究也成功地利用該方法構(gòu)建了西瓜枯萎病菌的轉(zhuǎn)化子庫。

研究表明，ATMT的轉(zhuǎn)化效率受受體菌菌株[11]、農(nóng)桿菌菌株及轉(zhuǎn)化載體[20]等方面因素的影響。本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)農(nóng)桿菌OD600為0.4、分生孢子濃度為1×106個/mL，于28 ℃共培養(yǎng)48 h時轉(zhuǎn)化效率最高，當(dāng)AS濃度為200 μmol/L時，轉(zhuǎn)化效率高達(dá)（663.33±24.95）個/106孢子，顯著優(yōu)于鄭肖蘭等[3]和梁慎等[4]的研究結(jié)果。鄭肖蘭等[3]的研究表明分生孢子濃度以（0.1～5.0）×106個/mL為宜，與本研究并不一致；另外，鄭肖蘭等[3]和梁慎等[4]所選用的雙元載體、病原菌菌株以及菌株對潮霉素的抗性均與本研究不同，這可能是導(dǎo)致研究結(jié)果不同的原因之一。

絲狀真菌中，單個基因的缺失常造成多個表型的變異。Hou等[21]發(fā)現(xiàn)MAPK途徑中的MGV1基因缺失后，合谷鐮刀菌的產(chǎn)孢量、育性以及侵染小麥的能力均發(fā)生了變異。Yang等[22]克隆到稻瘟菌致病相關(guān)基因Com1，該基因缺失后孢子形態(tài)發(fā)生變異，附著胞膨壓下降并且喪失了致病性。西瓜枯萎病是一種土傳病害，病原菌主要從根部侵入，破壞微管組織，然后造成植株萎蔫并最終死亡。病原菌致病相關(guān)突變體的篩選需要大量的人工接種試驗，限制了致病性相關(guān)突變體的大規(guī)模篩選工作。本研究通過對轉(zhuǎn)化子的表型觀察和產(chǎn)孢能力評估，初步獲得了73個突變體，但相關(guān)的缺失基因是否和病原菌的致病性相關(guān)，還需要開展進(jìn)一步的研究。

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