高效液相色譜法測定養(yǎng)殖水體中的亞甲基藍

龍舉

摘要

[目的]探討一種高效液相色譜法測定水產(chǎn)養(yǎng)殖水體環(huán)境中亞甲基藍含量的分析方法，為亞甲基藍測定方法的建立提供參考。[方法]將水樣經(jīng)預處理后利用二氯甲烷萃取，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀抽真空濃縮凈化后高效液相色譜-紫外檢測器檢測，采用外標法定量分析。[結(jié)果]亞甲基藍在0.05～1.00 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性相關系數(shù)均大于0.999；在 0.06～0.80 mg/L添加范圍內(nèi)的平均回收率為75.2%～86.0%，相對標準偏差均小于12.0%；方法定量限為0.05 mg/L。[結(jié)論]該方法的重現(xiàn)性較好，操作方便，定性準確且回收率較高，能夠用于快速分析水產(chǎn)養(yǎng)殖水體環(huán)境中亞甲基藍含量。

關鍵詞高效液相色譜；養(yǎng)殖水體；環(huán)境；亞甲基藍

中圖分類號S949文獻標識碼A文章編號0517-6611（2015）24-005-02

亞甲基藍（methylene blue，MB） 是一種人工合成的噻嗪類染料，被廣泛應用于化學指示劑、染料、生物染色劑和藥物等方面。基于亞甲基藍的氧化還原性，它作為藥物使用時主要用作解毒劑，可用于亞硝酸鹽、氰化物、硝基苯、乙酰苯胺等藥物中毒以及氨基比啉、磺胺類等藥物引起的高鐵血紅蛋白癥。作為消毒劑使用的亞甲基藍基于在水溶液中離子型的亞甲基藍與微生物酶系統(tǒng)競爭氫離子，使酶處于無活性的氧化狀態(tài)，微生物因缺乏酶而失去生存能力。亞甲基藍對防治淡水魚的水霉病、紅嘴病、小瓜蟲病等有很好的療效。由于亞甲基藍毒性比孔雀石綠低，近年來作為孔雀石綠、硝基呋喃等禁藥的替代品在水產(chǎn)養(yǎng)殖中得到廣泛應用。亞甲基藍也被用作抗真菌劑用來降低魚類運輸途中的死亡率。由于亞甲基藍及其代謝物被認為對動物體有毒性且有致突變作用，在20世紀90年代美國、日本等國家禁止將其用于水產(chǎn)養(yǎng)殖。

亞甲基藍的大量使用或濫用對養(yǎng)殖水生物會產(chǎn)生一定的毒副作用，通過生物富集作用在水生生物體中積累一定量的殘留，對食品安全和人類健康構(gòu)成新的隱患。目前，有關亞甲基藍殘留的檢測方法主要為水產(chǎn)品中亞甲基藍殘留的檢測，其方法有分光光度法、高效液相色譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、毛細管電泳法等。控制養(yǎng)殖水體環(huán)境中的亞甲基藍可以直接減少水生生物體對亞甲基藍的生物累積量，有效控制養(yǎng)殖水產(chǎn)品體內(nèi)亞甲基藍的攝入量。檢測水產(chǎn)養(yǎng)殖水體環(huán)境中亞甲基藍含量對了解養(yǎng)殖環(huán)境安全狀況、控制養(yǎng)殖水生物過多積累亞甲基藍和水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管工作具有積極意義。而對于水產(chǎn)養(yǎng)殖水體環(huán)境中亞甲基藍含量的檢測，目前還沒有相關的檢測方法。根據(jù)亞甲基藍的化學性質(zhì)，選擇適合的前處理方法，優(yōu)化儀器分析條件，建立了一種檢測養(yǎng)殖水體中亞甲基藍的高效液相色譜法。

1材料與方法

1.1儀器和試劑

高效液相色譜儀：美國Waters 2695-2489紫外/可見光檢測器；色譜柱：XbridgeTM C18柱；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士BUCHI公司；分液漏斗振蕩器，北京國環(huán)高科自動化技術(shù)研究院；二氯甲烷（農(nóng)殘級）、甲醇、甲酸、乙腈（均為色譜純），德國Merck公司；亞甲基藍，美國Sigma公司；鹽酸（優(yōu)級純），中國上海試劑總廠；試驗用蒸餾水為重蒸水，自動電熱純水蒸餾器制備。

1.2液相色譜條件

色譜條件：XbridgeTM C18柱，5.0 μm ，4.6×250 mm；柱溫：30 ℃；流動相：濃度0.1 %甲酸水溶液-乙腈（62∶38，V/V）；流速：1.0 ml/min；進樣量：50 μl；紫外檢測波長：655 nm。

1.3試驗方法

1.3.1樣品處理。采集水樣，立即用0.01 mol/L鹽酸浸泡過半小時的0.45 μm濾膜進行抽濾處理，將抽濾所得水樣轉(zhuǎn)移至樣品瓶中，4～8 ℃保存。待水樣至室溫，準確量取經(jīng)過濾后的水樣250 ml，轉(zhuǎn)移到500 ml分液漏斗中，加入50 ml二氯甲烷萃取，振蕩1 min后靜置20 min，待分液漏斗中液體穩(wěn)定且出現(xiàn)明顯分層后，把下層二氯甲烷轉(zhuǎn)移到100 ml旋蒸瓶中，在40～45 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至蒸干。取下旋蒸瓶之后，往旋蒸瓶中準確加入1.0 ml甲醇溶解殘留物，并將膠頭吸管伸入瓶中，利用加入的甲醇清洗旋蒸瓶內(nèi)壁。靜置旋蒸瓶，待內(nèi)壁上的液體完全流下，吸取瓶中提取液，過0.22 μm有機相微孔濾膜待測。

1.3.2標準曲線繪制。

用色譜甲醇配制濃度分別為0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg/L的亞甲基藍標準溶液，進行高效液相色譜紫外檢測。根據(jù)樣品目標峰的保留時間定性，以峰面積為縱坐標，以亞甲基藍的質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制標準工作曲線，以外標法定量計算亞甲基藍的含量。

2結(jié)果與分析

2.1提取方法的確定

亞甲基藍易溶于乙腈、甲醇、二氯甲烷等有機溶劑。對于水產(chǎn)品中亞甲基藍的提取，楊方等用離子對試劑（對甲苯磺酸的乙酸銨緩沖液-乙腈）提取；宮向紅等選擇用乙酸銨緩沖液和乙腈提取；王媛等直接用乙腈提取。他們的一個共同點是都使用二氯甲烷反萃。由于乙腈與水不能明顯分層，該試驗選擇二氯甲烷作為提取試劑。在分液漏斗的樣品中加入一定量的二氯甲烷，劇烈振蕩后靜置，待分液漏斗中液體穩(wěn)定且出現(xiàn)明顯分層后，把下層二氯甲烷轉(zhuǎn)移到旋蒸瓶中，在40～45 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至蒸干。向旋蒸瓶中準確加入1.0 ml甲醇溶解殘留物，并且將膠頭吸管伸入瓶中，利用加入的甲醇清洗旋蒸瓶內(nèi)壁。試驗表明，該提取方法基質(zhì)影響較小，可以直接供液相色譜上機分析。

2.2色譜條件及色譜圖

關于流動相的配制，選擇較多的有乙腈和0.125 mol/L乙酸銨溶液、甲醇和濃度0.1%甲酸水溶液等。結(jié)合實驗室儀器性能和試劑選擇性，選擇濃度01%甲酸水溶液-乙腈（60∶40，V/V）、乙腈-0.125 mol/L乙酸銨溶液水（70∶30，V/V）、甲醇濃度-0.1 %甲酸水溶液（45∶55，V/V）等。經(jīng)過試驗優(yōu)化比較，在紫外波長655 nm處，以濃度0.1%甲酸水溶液-乙腈（62∶38，V/V）作為流動相的效果最好，可以有效地將亞甲基藍完全分離，不受雜峰干擾，且色譜峰峰形尖銳，對稱性好，能滿足亞甲基藍的檢測分離要求。所以，選擇濃度0.1%甲酸水溶液-乙腈（62∶38，V/V）作為流動相。以該試驗方法和色譜條件，亞甲基藍在色譜圖上保留時間約為3.50 min。亞甲基藍標準溶液的高效液相色譜圖如圖1所示，空白樣品加標色譜圖如圖2所示。

2.3標準曲線及線性方程

采用高效液相色譜-紫外/可見光檢測器進行色譜分析，以峰面積為縱坐標（Y） ，以亞甲基藍的質(zhì)量濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線。由圖3可知，線性方程為Y=3.88×105X-5.83×103，線性相關系數(shù)（R2）=0.999 287，說明亞甲基藍在0.05～1.00 mg/L 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈線性關系，能夠進行準確定量。

2.4方法回收率和精密度

分別取養(yǎng)殖水樣空白樣品各250 ml于500 ml分液漏斗中，加入相當于水樣含量為0.06、0.10、0.20、0.40、0.80 mg/L亞甲基藍，每個添加水平做6個平行，測定亞甲基藍含量，計算回收率和相對標準偏差。由表1可知，方法回收率為75.2%～86.0%，相對標準偏差均小于12%。可見，該試驗方法有較高的回收率和精密度。

2.5檢出限

參考Waters 2695液相色譜儀靈敏度的要求，通過空白養(yǎng)殖水樣加標液逐級稀釋，以信噪比S/N =3的樣品質(zhì)量濃度為方法檢出限，取信噪比S/N =10的樣品質(zhì)量濃度為方法定量限，計算出方法中亞甲基藍的檢出限為0.05 mg/L。

2.6實際水樣的測定

采用建立的高效液相色譜法測定養(yǎng)殖水體環(huán)境中亞甲基藍含量的方法，分別對A、B兩地烏鱧

養(yǎng)殖塘中的水樣進行20批次檢測，未發(fā)現(xiàn)陽性樣品。據(jù)實地了解，得知這兩處養(yǎng)殖均未使用過亞甲基藍。

3結(jié)論

該試驗研究了高效液相色譜法測定養(yǎng)殖水體環(huán)境中亞甲基藍殘留量的提取、濃縮和分析條件，建立了可以成功用于養(yǎng)殖水體環(huán)境中亞甲基藍殘留量的分析方法。該試驗方法的測定結(jié)果能夠真實反映養(yǎng)殖水體環(huán)境情況，可以作為一個衡量養(yǎng)殖水體環(huán)境質(zhì)量的指標。管理者可以根據(jù)需要對養(yǎng)殖水體中亞甲基藍進行長期監(jiān)測。這對于控制水體環(huán)境有著重要意義。適時監(jiān)測數(shù)據(jù)則對了解養(yǎng)殖的經(jīng)濟類水生物體內(nèi)亞甲基藍殘留情況有一定的指導作用。在試驗過程中，該方法有試劑干擾少、方法回收率高、重現(xiàn)性好、操作簡單、精密度高等優(yōu)點，能夠滿足養(yǎng)殖水體環(huán)境中亞甲基藍含量的測定要求。

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