外植體選取與低溫處理對花椰菜不育系誘導培養的影響

劉慶　朱世楊　張小玲　朱婷婷　羅天寬

摘 要：為給‘甌雪60天制種母本9901A（隱性核不育系）的快速繁殖提供依據，研究了花椰菜花球采收期、20 cm抽薹期、開花期不同部位取材外植體對誘導培養的影響。結果表明：不同生育階段不同部位取材外植體的愈傷組織誘導率均為100%。不同階段不同部位外植體誘導出芽效果存在差異，以開花期花托誘導出芽數量最多，采收期3 mm厚花枝誘導出芽數量次之，20 cm抽薹期則誘導不出芽。4℃低溫處理l天采收期花球表面花枝的誘導效果較好，而低溫處理3、7天的誘導效果有所降低。

關鍵詞：外植體選取；低溫處理；花椰菜不育系；誘導培養

中圖分類號：S635.3

文獻標志碼：A

論文編號：2014-0205

0 引言

‘甌雪60天是溫州市農業科學研究院利用花椰菜隱性細胞核雄性不育系9901A為母本，優良白交系9908為父本，培育而成的花椰菜雜交組合。該組合于2009年12月通過浙江省非主要農作物品種審定委員會審定，審定編號為浙（非）審蔬20090016。該組合已在浙江溫州、四川成都等地方大面積推廣應用。由于‘甌雪60天制種母本9901A系隱性細胞核雄性不育系，不易通過種子繁殖母本進行制種，限制了其大規模的推廣應用。應用植物組織培養技術可以繁殖保持花椰菜的優良特性。前人已經開展了一些花椰菜組織培養方面研究。如吳麗芳等以花球為外植體研究了花椰菜不育系組培快繁和無糖牛產技術；張小玲等以未受精子房、花托、花序軸為外植體進行了花椰菜離體培養誘導成苗研究；黃俊軒等以花椰菜葉片為外植體研究了其離體再牛技術；許端祥等則以腋芽為材料開展了花椰菜白交不親和系的組培快繁研究。然而，關于花椰菜隱性細胞核雄性不育系不同牛育階段不同部位外植體誘導培養的研究尚未見報道。為此，筆者以‘甌雪60天核不育系母本9901A為材料，開展不同牛育階段不同部位取材外植體對誘導培養影響的研究，以為‘甌雪60天制種母本快速繁殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

1.1.1 外植體選取處理以‘甌雪60天母本9901A花球采收期（2010年12月30日）、20 cm抽薹期（2011年1月21日）、開花期（2011年3月10日）3個牛育階段不同部位外植體為接種材料，設置處理：（1）采收期花球表面3 mm厚花枝；（2）20 cm抽薹期由上端往下數的頂端以及第一、二、三分枝（圖l左）；（3）開花期由頂端往下數的花托、花柄以及第一、二分枝（圖1右）。

1.1.2 外植體低溫處理以‘甌雪60天母本9901A采收期花球表面3 mm厚花枝為接種材料，于4℃冰箱中分別低溫處理0、l、3、7天，然后供接種用。

1.2 誘導培養

1.2.1 誘導培養基配方所用培養基為MS+2，4-D 0.01 mg/L+BA l mg/L +NAA 0.001 mg/L.蔗糖濃度為3.0%，瓊脂濃度為0.7%，pH 5.8。

1.2.2 無菌接種誘導培養取上述外植體無菌接種，然后置于培養室（溫度24士2℃，每天光照12 h，黑暗12 h）中誘導培養。接種時將外植體切成2—3 mm，每瓶接種5小塊，每處理接種30瓶。50天后，隨機挑選4瓶，統計愈傷組織誘導率和誘導芽數。

愈傷組織誘導率=（帶有愈傷組織外植體數/接種外植體數）X100%；

誘導芽數=誘導出的芽數/接種外植體數。

1.3 數據分析

數據用Excel分析軟件進行統計和分析。

2 結果與分析

2.1 外植體選取時期和部位對花椰菜誘導培養的影響

由表l可知，‘甌雪60天母本9901A花球采收期、20 cm抽薹期、開花期3個生育階段不同部位外植體接種后愈傷組織誘導率均100%。但是，不同牛育階段不同取材部位外植體的誘導出芽數存在差異。其中，采收期3 mm厚花枝誘導芽數為3個/外植體；20 cm抽苔期各部位取材均誘導不出芽；開花期花托、花柄以及第一、二分枝誘導芽數分別為3.7、2.7、2.7、1.2個/外植體。

2.2 外植體低溫處理時間對花椰菜誘導培養的影響

由表2可以看出，適宜時間的4℃低溫處理可以提高花椰菜采收期花球表面3 mm厚花枝的誘導效果。其中4℃低溫處理0、1、3天，愈傷組織誘導率均為100%；4C低溫處理7天，愈傷組織誘導率則降為75%。4℃低溫處理0、1、3、7天，誘導芽數分別為3、5、2.5、1個/外植體。說明，外植體4℃低溫處理l天誘導效果最佳。

3 結論與討論

‘甌雪60天母本9901A為隱性核基因控制的不育系，沒有保持系，無法自身繁殖，用組織培養方法可以在短期內擴繁獲得大量不育系種苗，滿足生產上制種的需要。誘導培養是花椰菜組織培養的一個關鍵階段，所用外植體可以是未受精子房、花托、花序軸、葉片、葉柄、腋芽、莖節段、花球等組織器官，但不同外植體及其選取時期與部位對誘導效果產牛的影響可能不同。因此，對‘甌雪60天母本9901A不同牛育階段不同部位取材外植體誘導培養研究具有重要的意義。

本研究發現，‘甌雪60天母本花球采收期、20 cm抽薹期、開花期3個生育階段不同部位取材外植體的愈傷組織誘導率均為100%。說明取材時期和部位對花椰菜愈傷組織誘導影響不大。這與李曙軒和裘文達在‘80天花椰菜花球組織或花序柄組織培養中發現有90%～100%的切段都能形成愈傷組織的結論基本一致。但是，花椰菜誘導出芽效果因外植體取材時期和部位而異，其中開花期花托誘導出芽效果最好，采收期3 mm厚花枝效果次之，而20 cm抽苔期則誘導不出芽。說明，開花期花托是‘甌雪60天母本誘導培養的理想材料。這與張小玲等以花椰菜‘圓葉80天和‘青葉100天為材料，研究發現花椰菜誘導出芽數量以花托為最多的結果是一致的。

低溫處理能夠促進植物誘導培養。本研究還發現，花椰菜采收期花球外植體4℃低溫處理l天，誘導芽數最多，而4℃低溫處理3、7天愈傷組織誘導率和芽數均有所降低。說明，4℃低溫處理l天誘導效果最佳，也表明低溫處理能夠促進愈傷組織誘導及芽分化。這與前人在結苜蓿、縷草、擬南芥菜、小麥、馬鈴薯、油茶、胡麻等研究結果有所類似，但這一結果的具體作用原理還有待進一步的探討研究。在實際牛產中，可以考慮將母本采收期割球采下的花枝4℃貯藏后接種誘導培養，既能提高誘導芽數，又可提高割球采下花枝的利用價值，而不會影響單株花數降低種子產量；同時可提早進入增值擴繁提高組培效率。

綜上所述，‘甌雪60天母本花球采收期、20 cm抽薹期、開花期不同部位取材外植體的愈傷組織誘導率均為100%。但是誘導出芽效果以開花期花托最好，采收期3 mm厚花枝次之，20 cm抽薹期誘導不出芽。4℃低溫處理l天可以提高采收期花球表面花枝誘導效果，但低溫處理3、7天后誘導效果有所降低。本試驗結果是基于單個花椰菜不育系品種誘導培養的，研究結果是否適用于其它花椰菜不育系材料尚需進行驗證。此外，誘導培養僅僅是花椰菜組織培養的一個階段，還需對其繼代培養和牛根培養做進一步的探索。