高磷、高鈣誘導人血管平滑肌細胞鈣化的研究

傅碧玲，鄒世海，彭 鑫，翁俊雄，鄧柳霞

(深圳市寶安區人民醫院 腎臟內科，廣東 深圳 518101)

終末期腎臟病(end stage renal disease，ESRD)患者首位死亡原因是心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)。心血管事件的增加與患者普遍存在血管鈣化尤其是冠脈血管鈣化或心瓣膜鈣化相關，而血管的鈣化又與高磷血癥、鈣磷代謝紊亂密切相關，高達83%慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)5 期患者有不同程度的血管鈣化，71%的CKD 患者存在明顯的頸動脈和股動脈鈣化斑塊。血磷濃度每升高0.3 229 mmol/L，患者血管鈣化風險上升61%，心血管事件發生率增加31%，心血管死亡風險增加50%［1］。高磷是礦物質代謝紊亂的核心［2］，并認為血磷干預優先于甲狀旁腺激素(PTH)。目前對于高鈣、高磷導致血管鈣化的機制尚未完全明確，如何進行有效干預，措施亦有限［3］。故本研究將人血管平滑肌細胞在體外模擬高鈣、高磷條件下培養，觀察成骨細胞標志物及原有平滑肌細胞標志物表達有無變化，探討高鈣、高磷與血管平滑肌細胞表型轉分化、鈣化的關系及分子機制，并用阻斷劑進行干預，為鈣磷代謝紊亂的治療提供新理論依據和靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

無內毒素人血清白蛋白(HSA)購自Sigma 公司(美國)，高糖DMEM 培養基購買自Hyclone 公司(法國)，胰蛋白酶(Trypsin)購自Amresco 公司(美國)，胎牛血清購自中國杭州四季青公司，鼠抗α-SMA 抗體、鼠抗山羊Cbfα1 多克隆抗體、鼠抗骨鈣素抗體購自中杉金橋生物技術有限公司，RTPCR 試劑盒購自TaKaRa 公司(日本)，ZVAD-FMK購自Tocris Cookson 公司，其它試劑為國產分析純。

1.2 人臍動脈平滑肌細胞的培養

采用植塊貼壁法獲取人原代臍血管平滑肌細胞。無菌條件下獲取健康胎兒臍帶約20 cm，置于無菌DMEM 培養液中，于分娩后2 h 內送至細胞培養室。用無菌PBS 反復沖洗臍帶至沖凈為止，用眼科鑷盡量去除血管外膜的結締組織，再剪開血管，沖洗血管壁數次，用濕棉簽輕輕刮除血管內皮，將處理好的中膜放入另一無菌小燒杯中。用眼科剪將中膜剪成約0.5 ～1 mm3大小的小塊，接種于25 mL 塑料培養瓶中，加入4 mL 含20%胎牛血清的DMEM 培養液，37 ℃，95% 空氣－5% CO2培養。0.25%胰蛋白酶消化、傳代，傳代后用含10%胎牛血清的DMEM 培養液培養。采用形態學及免疫組化a-SMA 染色方法進行平滑肌細胞鑒定。實驗用第5 ～10 代細胞。

1.3 實驗分組

將細胞以105/孔接種于6 孔細胞培養板中，細胞長至80%融合時更換細胞培養基分組培養。以CaCl2，NaH2PO4調節培養液中鈣(Ca)、磷(P)濃度，分為以下4 組:對照組(1.4 mmol/L P，2.0 mmol/L Ca);高磷組(2.0 mmol/L P;2.0 mmol/L Ca);高鈣組(1.4 mmol/L P;2.8 mmol/L Ca);高磷+高鈣組(2.0 mmol/L P;2.8 mmol/L Ca)。以換用培養液當天定義為第0 天，培養至第12 天，隔天換液。

1.4 人血管平滑肌細胞核心結合因子α1(Cbfα1)、骨鈣素、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)蛋白質的表達

收集各組第12 天細胞，裂解后取上清液，測定蛋白濃度，取30 μg 細胞總蛋白配成等體積等量，于沸水中煮5 min，10% SDS-聚丙烯酰胺電泳分離，電轉移蛋白至硝酸纖維素膜膜上，5%無脂奶粉封閉，一抗孵育雜交過夜，分別為α-SMA 單克隆抗體(1∶1 000)、Cbfα1 多克隆抗體(1∶500)、骨鈣素多克隆抗體(1∶500)，洗膜后在過氧化物酶標記的抗鼠IgG 中孵育1 h，最后用化學發光法以X 線片自顯影顯示結果。圖像經BioRad 公司的圖像分析軟件Quantity One 對特異性條帶進行灰度掃描分析，求得各組蛋白電泳條帶灰度與內參GAPDH 的比值，反映為Cbfα1、骨鈣素、α-SMA 表達含量變化，從而對目的蛋白進行半定量比較。實驗重復3次。

1.5 Cbfα1、骨鈣素、α-SMA mRNA 的表達

收集各組細胞，提取細胞總RNA，以RT-PCR法得到擴增產物，PCR 產物電泳及分析:凝膠在UVP 凝膠成像系統中掃描觀察結果、拍照，分析電泳帶灰度，計算Cbfα1、骨鈣素、α-SMA mRNA 特異性擴增帶灰度與內參GAPDH 擴增帶灰度之比值，即為Cbfα1、骨鈣素、α-SMA mRNA 相對表達量。實驗重復3 次。

1.6 ZAVD-FMK 對高磷培養的人臍動脈平滑肌細胞鈣化的干預

將細胞以105/孔接種于6 孔細胞培養板中，細胞長至80%融合時更換細胞培養基分組培養。以CaCl2，NaH2PO4調節培養液中鈣(Ca)、磷(P)濃度，分為以下3 組:對照組為正常鈣、磷組(1.4 mmol/L P，2.0 mmol/L Ca);高磷高鈣組(2.0 mmol/L P;2.8 mmol/L Ca);高磷高鈣+ZAVD-FMK 組(2.0 mmol/L P;2.8 mmol/L Ca;10 μmol/L ZAVD-FMK)。收集各組第12 天細胞，按照1.4 項下方法檢測Cbfα1、骨鈣素蛋白質的表達。

1.7 統計學處理

所有數據均代表3 次以上重復實驗的結果，計量資料以均數±標準差)表示，采用SPSS 13.5 統計軟件分析，組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，P ＜0.05 為具有統計學意義。

2 結果

2.1 血管平滑肌細胞的鑒定

血管植塊貼壁培養7 d 左右，有少許平滑肌細胞開始從植塊周邊遷出;第14 天時，植塊周圍形成明顯的平滑肌細胞生長暈，并圍繞植塊邊緣呈束狀向外放射延伸，細胞呈長梭形，胞質豐富，均質透明，可隱約看到細絲。細胞有較多的突起，核卵圓居中，可見1 ～2 個核仁。經過3 ～4 周培養，植塊的生長暈不斷擴大，彼此融合，細胞密集呈束狀放射狀排列，形成典型的“峰、谷”樣生長特征。免疫組化α-SMA 染色顯示細胞胞漿內α-SMA 表達豐富，呈細絲狀沿細胞縱軸排列。95%細胞α-SMA表達為陽性，純度符合試驗要求。

2.2 Cbfα1、骨鈣素、α-SMA 表達

與對照組相比，高鈣組、高磷組、高磷+高鈣組中Cbfα1、骨鈣素蛋白的表達均明顯增加(P ＜0.05)，其中，高磷+高鈣組Cbfα1 的表達為對照組的(3.46±0.44)倍，骨鈣素的表達為對照組的(2.92±0.38)倍;與對照組相比，高鈣組、高磷組、高磷+高鈣組α-SMA 的表達均明顯減低(P ＜0.05)，其中高磷+高鈣組α-SMA 表達較對照組降低(59.61±4.98)%。見圖1。

圖1 人平滑肌細胞Cbfα1、骨鈣素、α-SMA蛋白表達(Western blot，第12 天)Fig.1 The protein expression of Cbfα1，osteocalcin and α-SMA of VSMCs on 12th day

2.3 Cbfα1、骨鈣素、α-SMA mRNA 表達

與對照組相比，高鈣組、高磷組、高鈣+高磷組Cbfα1、骨鈣素mRNA 的表達均顯增加(P ＜0.05)，其中，高鈣+高磷組Cbfα1 的表達為對照組的(2.12±0.78)倍，骨鈣素的表達為對照組的(2.37±0.65)倍;與對照組相比，高鈣組、高磷組、高鈣+高磷組α-SMA 的表達均明顯減低(P ＜0.05)，其中高鈣+高磷組α-SMA 表達較對照組降低(45.12±3.22)%。見圖2。

2.4 ZAVD-FMK 干預高磷+高鈣培養條件下VSMCs Cbfα1、骨鈣素蛋白的表達

與對照組相比，高磷+高鈣組Cbfα1、骨鈣素的表達均顯增加(P ＜0.05);與高磷+高鈣組相比，使用ZAVD-FMK 干預后，Cbfα1 表達降低(33.06±4.12)%，骨鈣素的表達降低(35.92±3.38)%。見圖3。

3 討論

圖2 平滑肌細胞Cbfα1、骨鈣素、α-SMA mRNA表達(Western blot，第12 天)Fig.2 The mRNA expression of Cbfα1，osteocalcin and α-SMA of VSMCs on 12th day

圖3 ZVAD-FMK 干預時人平滑肌細胞中Cbfα1、骨鈣素蛋白質表達影響(Western blot，第12 天)Fig.3 The protein expression of Cbfα1，osteocalcin and α-SMA of VSMCs with intervention of ZVAD-FMK on 12th day

高磷血癥是全因死亡及心血管死亡的獨立危險因素［4］。臨床上如何保持鈣磷代謝平衡，CKDMBD 治療時機問題等，都是亟待解決的難點［5］。故本研究旨在通過體外實驗觀察高磷如何參與血管鈣化，并探討其可能的分子機制。血磷升高通過多種途徑觸發血管鈣化［6-7］:(1)介導VSMCs 細胞轉錄因子Runx2 的表達，從而使VSMCs 向成骨細胞分化;(2)導致VSMCs 細胞凋亡或壞死后產生的基質囊泡是血管鈣化的起始點;(3)同時抑制血管壁中VSMC 向破骨細胞的分化，使得血管鈣化無法逆轉;(4)誘發骨細胞對FGF23 的過表達最終造成血管鈣化。而本研究側重于觀察人血管平滑肌細胞在體外模擬高鈣、高磷條件下培養，其成骨細胞標志物及原有平滑肌細胞標志物表達發生變化的情況，從而探討高鈣、高磷與血管平滑肌細胞表型轉分化、鈣化的關系。

Cbfα 1 是成骨細胞分化的必需轉錄因子，多種成骨相關蛋白基因的啟動子具有Cbf α 1 結合位點，如OPN，骨鈣素，ColI 等。骨鈣素是成骨細胞合成并分泌的，比較穩定，臨床上常通過血清骨鈣素了解新形成的成骨細胞的活動狀態。骨鈣素的出現，表明表達成骨細胞表型的細胞在血管鈣化的發生過程中起中心作用，與血管鈣化直接相關。本研究通過對VSMCs 在高鈣、高磷條件下是否表達參與骨形成的蛋白Cbfα-1、骨鈣素，繼而發生平滑肌細胞向成骨樣細胞的轉化，進而促進血管鈣化，在細胞水平進行了探討。采用人原代VSMCs，在高磷和(或)高鈣的條件下培養12 d，Western blot 及RT-PCR 的結果均顯示，成骨細胞的標志蛋白Cbfα-1、骨鈣素表達增強，而肌成纖維細胞的特異性標志物α-SMA 表達下降。Cbfα 1、下游蛋白骨鈣素等的表達增加提示VSMCs 出現了成骨細胞的特征，α-SMA 表達下降，提示VSMCs 逐漸喪失血管平滑肌細胞的特性，并向成骨細胞轉化。

因此本研究結果證實了高鈣、高磷可導致人VSMCs 細胞轉化為成骨樣細胞，這可能是ESRD患者發生血管鈣化的機制之一。那么，如何阻斷鈣化的進程，已有不少學者作出有益的探討。Zavaczki E［8］的研究表明硫化氫可以抑制高磷所致的鈣化和VSMC 向成骨細胞的轉分化。也有研究證實，凋亡可以促進血管平滑肌細胞鈣化。本試驗發現，運用凋亡抑制劑(caspase 抑制劑)ZAVD-FMK，可以一定程度上抑制高磷和(或)高鈣培養所致的血管平滑肌細胞表現轉分化(或鈣化)，提示高磷培養促細胞鈣化與其促凋亡作用相關。

綜上所述，本實驗體外研究模擬了細胞處于高磷和(或)高鈣的條件下，通過α-SMA、Cbfα 1、骨鈣素等蛋白表達的變化，間接證實了VSMCs 發生表型的轉分化，使用非特異性的caspase 抑制劑ZAVD-FMK 可以干預這一進程。表明鈣化的發生與血管平滑肌細胞凋亡及成骨分化有關。提示，在臨床上治療CKD-MBD 需率先從鈣磷代謝紊亂著手，并為其治療提供新的靶點和思路。

［1］Eddington H，Hoefield R，Sinha S，et al.Serum phosphate and mortality in patients with chronic kidney disease［J］.Clin J Am Soc Nephrol，2010(12):2251－2257.

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［3］Palit S，Kendrick J1.Vascular calcification in chronic kidney disease:role of disordered mineral metabolism［J］.Curr Pharm Des，2014(37):5829－5833.

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［5］Martin KJ，González EA.Prevention and control of phosphate retention/hyperphosphatemia in CKD-MBD:what is normal，when to start，and how to treat?［J］.Clin J Am Soc Nephrol，2011(2):440－446.

［6］Liu XF.The mechanisms of high-phosphate-induced vascular calcification in patients with chronic kidney disease［J］.Sheng Li Ke Xue Jin Zhan，2014(1):21－26.

［7］Kendrick J，Chonchol M.The role of phosphorus in the development and progression of vascular calcification［J］.Am J Kidney Dis，2011(5):826－834.

［8］Zavaczki E.Hydrogen sulfide inhibits the calcification and osteoblastic differentiation of vascular smooth muscle cells［J］.Kidney Int，2011(7):731－739.