不同產(chǎn)地金銀花指紋圖譜研究

楊欣欣，王 帥，包永睿，盧曉敏，孟憲生*

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600；2.遼寧省組分中藥工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116600；3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116600)

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不同產(chǎn)地金銀花指紋圖譜研究

楊欣欣1,2,3，王 帥1,2,3，包永睿1,2,3，盧曉敏1,2,3，孟憲生1,2,3*

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600；2.遼寧省組分中藥工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116600；3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116600)

目的：采用指紋圖譜技術(shù)對(duì)不同產(chǎn)地金銀花藥材進(jìn)行分析比較，為金銀花藥材質(zhì)量的綜合評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。方法：采用Agilent TC-C18色譜柱，流動(dòng)相為0.5%冰醋酸水溶液(A)—乙腈(B)梯度洗脫，波長(zhǎng)為327nm，對(duì)14種不同產(chǎn)地金銀花藥材進(jìn)行測(cè)定，建立金銀花的高效液相色譜指紋圖譜；采用程度相似度計(jì)算法，結(jié)合聚類(lèi)分析對(duì)金銀花藥材進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)其質(zhì)量和品質(zhì)。結(jié)果：對(duì)14種金銀花藥材進(jìn)行測(cè)定，建立金銀花藥材指紋圖譜，并確定14種不同產(chǎn)地金銀花藥材的18個(gè)共有峰，且14種金銀花藥材的指紋圖譜相似度在0.9以上。結(jié)論：不同產(chǎn)地金銀花藥材的指紋圖譜存在明顯差異，又存在一定程度的相關(guān)性，為金銀花的質(zhì)量考察、品種鑒定及劃分提供參考依據(jù)。

金銀花；高效液相色譜；指紋圖譜；程度相似度；聚類(lèi)分析

金銀花(FlosLoniceraeJaponicae)為忍冬科植物忍冬(LoniceraJaponicaThunb.)的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花[1]，性寒味甘苦，入肺、胃、大腸經(jīng)，具清熱解毒、宣散風(fēng)熱之功效，為臨床常用中藥，并有“中藥之中的青霉素”之稱(chēng)。現(xiàn)代研究表明，金銀花具有抑茵抗病毒、解熱消炎、保肝利膽、止血、降血脂、抗氧化等作用[2]。全國(guó)大部分地區(qū)均有分布，其中以山東的“東銀花”“濟(jì)銀花”和河南的“南銀花”“密銀花”最為道地，質(zhì)量最好。

金銀花化學(xué)成分復(fù)雜，目前已發(fā)現(xiàn)揮發(fā)油、黃酮類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、環(huán)烯醚萜類(lèi)、肌醇、皂甙及無(wú)機(jī)元素等成分。中藥含有的活性成分是中藥藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，單純一種活性成分均不能體現(xiàn)出中醫(yī)臨床用藥的整體療效，若以個(gè)別活性成分的含量作為中藥質(zhì)量控制指標(biāo)，而忽略中藥其他成分的作用難以確保中藥及其制劑的質(zhì)量。文獻(xiàn)研究表明金銀花的化學(xué)成分及其含量常會(huì)因其品種、產(chǎn)地、采收期、儲(chǔ)存和炮制方法等不同而有所不同，療效也有所差異。為更加科學(xué)全面地評(píng)價(jià)金銀花質(zhì)量品質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)收集了14個(gè)不同產(chǎn)地的金銀花藥材進(jìn)行高效液相色譜指紋圖譜測(cè)定，采用程度相似度計(jì)算法，并結(jié)合系統(tǒng)聚類(lèi)分析對(duì)金銀花質(zhì)量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，為金銀花的質(zhì)量考察、品種鑒定及劃分提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

AGILENT 1100 LC高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司，包括1100泵，自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器(DAD)，Agilent化學(xué)工作站)；PCWJ-10型超純水處理裝置(成都品成科技有限公司)。

1.2 試劑

甲醇(分析純，批號(hào)：20130304,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；冰醋酸(分析純，批號(hào)：20120627，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；乙腈(色譜純，批號(hào)：120714，瑞典Oceanpak Alexative Chemical公司)；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110753-200413)。

1.3 材料

收集產(chǎn)自山東、江西、河南、四川、湖北、浙江等地的金銀花藥材，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定為忍冬科植物忍冬(LoniceraJaponicaThunb.)的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花，具體藥材信息見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent TC-C18色譜柱(4.6mm×150mm，5μm)，流動(dòng)相：0.5%冰醋酸水溶液(A)-乙腈(B)(0～60min，B：5%→35%)，流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)327nm，柱溫30℃。

2.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱(chēng)取綠原酸對(duì)照品適量，置25mL容量瓶中，加甲醇制成41.184μg·mL-1的對(duì)照品溶液，備用。

表1 金銀花藥材收集信息

注：*為野生，其余為種植，其中S1為樹(shù)形四季花，S2為紅色金銀花，S3為大毛花。

2.3 供試品溶液制備

取金銀花藥材粉碎后過(guò)65目篩，精密稱(chēng)取藥材粉末約1.0g，置50mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，稱(chēng)定重量，超聲提取40min，室溫放置，再稱(chēng)重加入甲醇補(bǔ)足損失重量，濾過(guò)，取續(xù)濾液，用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.4 測(cè)定方法

取對(duì)照品溶液、供試品溶液各5μL進(jìn)樣分析，記錄60min色譜圖。以綠原酸對(duì)照品的色譜峰來(lái)確定供試品溶液中綠原酸的色譜峰，以供試品綠原酸峰的保留時(shí)間和峰面積為1，計(jì)算各峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度考察 精密稱(chēng)取S1號(hào)樣品山東平邑的金銀花粉末1g，按上述提取方法進(jìn)行提取，于高效液相連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖。對(duì)山東平邑金銀花連續(xù)5次進(jìn)樣的色譜峰進(jìn)行保留時(shí)間精密度考察，經(jīng)分析RSD%值均小于3%，表明儀器性能良好，符合指紋圖譜要求。

2.5.2 穩(wěn)定性考察 精密稱(chēng)取S1號(hào)樣品山東平邑的金銀花粉末1g，按上述提取方法進(jìn)行提取，分別于0h、2h、4h、6h、12h、24h進(jìn)樣，記錄色譜圖，經(jīng)分析色譜峰保留時(shí)間的RSD%值均小于3%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定，符合指紋圖譜要求。2.5.3 重復(fù)性考察 精密稱(chēng)取同一份樣品(S1號(hào))5份，按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行HPLC分析，每次10μL，記錄色譜圖，經(jīng)分析色譜峰保留時(shí)間的RSD%值均小于3%，表明重復(fù)性良好，符合指紋圖譜要求。

圖1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜

2.6 HPLC指紋圖譜質(zhì)量評(píng)價(jià)方法的確立

運(yùn)用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004 A版軟件，對(duì)不同產(chǎn)地的金銀花樣品進(jìn)行指紋圖譜相似度分析和匹配分析研究[3-5]，采用自動(dòng)匹配方法進(jìn)行相似性分析，結(jié)果見(jiàn)表2、圖3。

圖2 山東平邑金銀花HPLC圖譜

樣品編號(hào)S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12S13S14對(duì)照指紋圖譜S11.0000.9790.9940.9820.9980.9920.9980.8880.9890.9980.9980.9970.9660.9990.999S20.9791.0000.9950.9330.9630.9470.9790.7780.9410.9770.9650.9620.8970.9840.972S30.9940.9951.0000.9590.9840.9720.9930.8330.9670.9910.9850.9810.9330.9960.989S40.9820.9330.9591.0000.9890.9970.9850.9370.9950.9870.9890.9910.9940.9790.989S50.9980.9630.9840.9891.0000.9970.9940.9170.9960.9951.0000.9990.9800.9950.999S60.9920.9470.9720.9970.9971.0000.9910.9360.9990.9920.9970.9980.9910.9880.996S70.9980.9790.9930.9850.9940.9911.0000.8810.9871.0000.9950.9940.9660.9990.998S80.8880.7780.8330.9370.9170.9360.8811.0000.9430.8850.9140.9190.9690.8750.902S90.9890.9410.9670.9950.9960.9990.9870.9431.0000.9890.9960.9970.9920.9850.994S100.9980.9770.9910.9870.9950.9921.0000.8850.9891.0000.9960.9950.9690.9980.998S110.9980.9650.9850.9891.0000.9970.9950.9140.9960.9961.0000.9990.9790.9960.999S120.9970.9620.9810.9910.9990.9980.9940.9190.9970.9950.9991.0000.9820.9940.998S130.9660.8970.9330.9940.9800.9910.9660.9690.9920.9690.9790.9821.0000.9600.975S140.9990.9840.9960.9790.9950.9880.9990.8750.9850.9980.9960.9940.9601.0000.998對(duì)照指紋圖譜0.9990.9720.9890.9890.9990.9960.9980.9020.9940.9980.9990.9980.9750.9981.000

圖3 14種不同產(chǎn)地金銀花樣品匹配分析

2.7 指紋圖譜的聚類(lèi)分析

采用質(zhì)心聚類(lèi)法作為聚類(lèi)模式識(shí)別方法，取14批金銀花樣品的18個(gè)共有特征峰的絕對(duì)峰面積值，計(jì)算樣品的歐氏距離，對(duì)樣品進(jìn)行聚類(lèi)[6-10]，聚類(lèi)樹(shù)形圖見(jiàn)圖4。

3 討論

采用等度洗脫，色譜峰分離度達(dá)不到要求，且出峰時(shí)間太長(zhǎng)。因此，選擇梯度洗脫。由于金銀花水溶性成分中多為有機(jī)酸類(lèi)，可加入一定比例的醋酸調(diào)節(jié)pH，改善峰形及調(diào)整各峰的保留時(shí)間。通過(guò)考察甲醇-水、乙腈-水等洗脫系統(tǒng)，結(jié)果顯示乙腈-水梯度洗脫能滿足要求，最終選擇該洗脫系統(tǒng)。

圖4 金銀花樣品聚類(lèi)分析

綠原酸是金銀花藥材的主要活性成分，在指紋圖譜中峰面積相對(duì)較大且較穩(wěn)定，因此作為參比峰。同時(shí)，分析色譜圖譜結(jié)果顯示，各樣品主要色譜峰基本一致，但各峰的面積差異較大。因此，不同產(chǎn)地金銀花成分基本上一致，但各成分含量有一定的差異。結(jié)合聚類(lèi)分析和相似度考察兩種方法，表明金銀花藥材存在明顯的差異，又存在一定程度的相關(guān)性。

對(duì)不同產(chǎn)地的金銀花藥材聚類(lèi)分析，當(dāng)閾值T=20時(shí)，14個(gè)樣品可分為2個(gè)大類(lèi)，其中S13被單列為1類(lèi)，其他13個(gè)樣品為一大類(lèi)，說(shuō)明野生與非野生有差異；隨著閾值的減少，13個(gè)樣品被分為2個(gè)大類(lèi)，其中S8被單列為1類(lèi)，其他12個(gè)樣品分為1大類(lèi)；隨著閾值的逐漸減少，會(huì)發(fā)現(xiàn)山東平邑產(chǎn)金銀花藥材有差異， S1樹(shù)形四季花為S3大毛花的改良品種，有一定的相關(guān)性，親緣性較強(qiáng)，而S2紅色金銀花是變異品種，變異后存在明顯的差異。

本研究根據(jù)相似度的計(jì)算和聚類(lèi)分析結(jié)果，結(jié)果顯示金銀花藥材存在一定程度的相關(guān)性，野生和人工種植金銀花在質(zhì)量上有較大區(qū)別，不同產(chǎn)地的金銀花亦存在較大差異，同一產(chǎn)地由于基緣的不同也會(huì)存在差異。采用指紋圖譜法結(jié)合程度相似度和聚類(lèi)分析綜合評(píng)價(jià)金銀花藥材質(zhì)量，判斷結(jié)果更科學(xué)、更全面、更符合實(shí)際情況，為金銀花質(zhì)量的綜合評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。

[1] 中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì)．中國(guó)藥典[S]．一部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.

[2] 王力川．金銀花的化學(xué)成分及功效研究進(jìn)展[J]．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(5)：2036-2037.

[3] 王勇，梁瓊麟，胡坪，等．色譜及相關(guān)技術(shù)在中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)中的應(yīng)用[J]．色譜，2008，26(2)： 136-141.

[4] 易倫朝，吳海，梁逸曾．色譜指紋圖譜與中藥質(zhì)量控制[J]．色譜，2008，26(2)：166-171.

[5] 孫彩華．指紋圖譜在中藥研究領(lǐng)域的應(yīng)用[J]．中國(guó)藥業(yè)，2006，15(17)：25-27.

[6] 王文清，彭靜，萬(wàn)進(jìn)，等．不同產(chǎn)地大青葉質(zhì)量的化學(xué)模式識(shí)別研究[J]．中草藥，2007，38(6)：921-925．

[7] 李新蕊．主成分分析、因子分析、聚類(lèi)分析的比較與應(yīng)用[J]．山東教育學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，22(6)：23-26．

[8] 梁逸曾，俞如勤．化學(xué)計(jì)量學(xué)[M]．北京：高等教育出版社，2003：193．

[9] 張志祥，劉鵬，康華靖，等．基于主成分分析和聚類(lèi)分析的FTIR不同地理居群香果樹(shù)多樣性分化研究[J]．光譜學(xué)與光譜分析，2008, 28(9)：2081-2086．

[10] 劉歡，何忠俊，梁社往，等．不同產(chǎn)地滇重樓HPLC指紋圖譜及化學(xué)模式識(shí)別研究[J]．云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，28(1)：88-95．

(責(zé)任編輯：李嵐春)

Study on Fingerprints of Flos Lonicerea from Different Regions

Yang Xinxin1,2,3,Wang Shuai1,2,3,Bao Yongrui1,2,3,Lu Xiaomin1,2,3,Meng Xiansheng1,2,3*

(1.College of pharmacy,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Dalian 116600,China;2.Liaoning province multi-component Chinese Medicine Engineering Technology Research Center,Dalian 116600,China;3.Liaoning Province Modern Traditional Chinese Medicine Research and Engineering Laboratory，Dalian 116600,China)

Objective:Fingerprint technology was used to analyze Flos Lonicerea from different regions, which lay a foundation for the comprehensive evaluation of Flos Lonicerea’s quality.Methods:Using the Agilent TC-C18chromatographic column, mobile phase is 0.5% acetic acid aqueous solution (A)-acetonitrile (B), gradient elution, wavelength 327 nm. Under this condition, to analyze the 14 Flos Lonicerea from different regions and establish their fingerprints. And the degree of similarity calculation method combined with clustering analysis was adopted to analyze the drugs to evaluate their quality.Results:14 Flos Lonicerea from different regions were determined and the fingerprints were established. 18 common peaks were found and the similarity of the 14 species was above 0.9.Conclusion:The fingerprint of Flos Lonicerea herbs from different regions presence obvious differences and a certain degree of correlation, which provide certain reference for the quality investigation, species identification and classification ofFlosLonicerea.

FlosLonicerea;HPLC;Fingerprint Chromatogram;Extent Similarity;Clustering Analysis

2014-10-24

“十二五”“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專(zhuān)項(xiàng)(2013ZX09507005)

楊欣欣(1979-)，女，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)講師，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量分析及制藥工藝研究。E-mail：studiomx2006@126.com

孟憲生(1964-)，男，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幗M分配伍、代謝組學(xué)及藥品質(zhì)量分析。E-mail：mxsvvv@126.com

R284

A

1673-2197(2015)04-0017-04

10.11954/ytctyy.201505009