基于卵泡顆粒細胞凋亡研究歸腎育宮湯對免疫性卵巢早衰小鼠的治療作用＊

符小航 符海鴿 賀豐杰 車虹彩 楊鑒冰 崔曉萍

陜西中醫藥大學第二附屬醫院（咸陽712046）

卵巢早衰（Premature ovarian failure，POF）是指女性在青春期后至四十歲前發生的非生理性的月經停止，伴有潮熱、原發或繼發不孕、生殖器萎縮等癥狀的一種婦科內分泌性疾?。?］。POF的發病機制學研究表明顆粒細胞的過度凋亡是導致其發病的主要病因［2］，中醫藥在本病的治療去取得了良好的療效，陜西省名中醫楊鑒冰教授依據中醫“腎主生殖”理論，創立了歸腎育宮湯，臨床治療卵巢早衰取得了良好的效果［3－4］。實驗研究表明該方具有調節性激素水平的作用，對免疫學小鼠POF治療作用顯著［5］，本實驗擬觀察歸腎育宮湯對免疫性卵巢早衰小鼠卵泡顆粒細胞凋亡及凋亡調控基因Bcl－2／Bax蛋白表達的影響，現將研究結果匯報如下。

1 材 料 1.1 動 物 SPF級雌性昆明小鼠90只，體重（20±5）g，動物合格證號：SCX（陜）2007－001，購自西安交通大學醫學科研實驗動物中心。

1.2 藥 物 歸腎育宮湯組方：菟絲子20g，山藥、茯苓、制首烏、雞血藤、焦山楂各15g，枸杞子、川斷各12g，熟地、山萸肉、鹿角霜、紫河車、杜仲各10g，炙甘草6g，所有中藥購于陜西中醫學院第二附屬醫院中藥房，經檢驗為合格藥物，常規煎煮，濃縮后備用；結合雌激素片：美國輝瑞公司，批號：14040201。

1.3 試 劑 透明帶多肽3（ZP3）：南京金斯瑞生物科技有限公司，批號：5004321＿2；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑：美國西格瑪生物科技公司；Bcl－2、Bax一抗：北京博奧森生物技術有限公司；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（批號：14137200），瑞士羅氏公司。

1.4 儀 器 與 設 備 圖 像 采 集 系 統：NIKON.ACT－1 DXM1200日本尼康公司；光學顯微鏡：蔡司光學儀器（上海）國際貿易公司。

2 方 法 2.1 卵巢早衰（POF）模型制備 透明帶多肽溶液的配制：按每1.4445mg透明帶多肽粉（ZP3）配1mL三蒸水；免疫試劑和免疫強化試劑的配制：將ZP3溶液分別與弗氏完全佐劑和弗式不完全佐劑按1∶1比例配制成免疫試劑和免疫強化試劑；模型的復制：分別于第1天和第14天取0.1mL免疫試劑和免疫強化試劑多點注射于小鼠雙后腳掌及腹腔。

2.2 動情周期觀察 從免疫試劑注射后第1天起，每天上午用蘸生理鹽水的棉簽放入小鼠陰道，取陰道脫落細胞，涂片后吉姆薩染色，在光學顯微鏡下觀察動情周期的變化，若出現動情周期的紊亂則表示造模成功。

2.3 分組及給藥 將90只雌性小鼠稱重后按照體重編號，完全隨機法分為空白對照組、模型對照組、雌激素組、歸腎育宮湯大、中、小劑量組，每組15只。雌激素組用結合雌激素片0.125mg／（kg·d）；各中藥治療組按歸腎育宮湯大劑量組70g／（kg·d）、中劑量組35g／（kg·d）、小劑量組17.5g／（kg·d）灌胃，空白對照組、模型對照組給予生理鹽水灌胃，給藥4周。

2.4 TUNEL染色檢測細胞凋亡 TUNEL染色按照試劑盒說明書操作，主要操作步驟如下：常規石蠟切片脫蠟入水→蛋白酶K工作液21～37℃處理組織15min，PBS洗3min，3次→加TUNEL反應混合液（含TdT酶和dUTP的標記液），置于暗濕盒中37℃標記1h→PBS洗5min，5次→加封閉液，置于暗濕盒中37℃反應30min→PBS洗5min，5次→加DAB底物，15－25℃反應5min，鏡下淺棕色即可→PBS洗5min，5次→光鏡下觀察凋亡細胞并拍照。用光學顯微鏡觀察凋亡細胞，隨機選取5個視野結合凋亡細胞形態特征綜合判斷，對凋亡細胞進行計數。

2.5 卵泡顆粒細胞Bcl－2、Bax蛋白表達的測定 取小鼠卵巢，常規切片，脫蠟脫水，3%H2O2室溫孵育5～10min，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5min x2，5～10%山羊血清封閉，室溫孵育10min，一抗4℃過夜，二抗37℃孵10～30min，滴加堿性磷酸酶標記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育10～30min，顯色劑顯色3～15min，沖洗、復染、脫水、透明、封片后顯微鏡下觀察。采用Zeiss Imerger Al顯微鏡觀察，采用DXM1200FCCD圖像采集系統采集圖片，應用Image－Pro Plus5.1圖像分析系統測定其積分光密度。

2.6 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，對所有數據進行正態性、方差齊性檢驗，若方差齊多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為有統計學意義。

3 結 果 3.1 TUNEL法檢測歸腎育宮湯對卵巢早衰小鼠卵泡顆粒細胞凋亡的影響 TUNEL標記的陽性凋亡結腸上皮細胞呈深棕色，正常卵泡顆粒細胞呈藍色?？瞻讓φ战M小鼠卵泡顆粒細胞偶見凋亡，模型對照組小鼠卵泡顆粒細胞凋亡顯著增多（P＜0.05），表明由于卵泡顆粒細胞的過度凋亡最終導致了卵巢功能低下，形成卵巢早衰。結果見表1。

表1 歸腎育宮湯對卵巢早衰小鼠卵泡顆粒細胞凋亡數的影響（±s）

表1 歸腎育宮湯對卵巢早衰小鼠卵泡顆粒細胞凋亡數的影響（±s）

注：與空白對照組比較，△P＜0.05，▲P＜0.01；與模型對照組比較，◇P＜0.05，◆P＜0.01；與雌激素組比較，○P ＜0.05，●P ＜0.01；與大劑量組比較，☆P ＜0.05，★P ＜0.01

組 別 劑量kg·dTUNEL染色凋亡細胞計數（個）－－ 2.2±1.06模型對照組 －－ 45.36±4.28▲雌激素組 0.125mg 15.16±3.27◆歸腎育宮湯大劑量組 70g 6.69±3.25◆●歸腎育宮湯中劑量組 35g 10.26±3.57◆○歸腎育宮湯小劑量組 17.5g 18.82±4.41空白對照組◆★

3.2 歸腎育宮湯對卵巢早衰小鼠卵泡顆粒細胞Bcl－2、Bax蛋白表達的影響 表明雌激素、歸腎育宮湯大、中、小劑量組藥物可通過調節胞Bcl－2和Bax蛋白的表達對卵泡顆粒細胞的過度凋亡起到抑制作用。結果見表2。

表2 各組大鼠結腸上皮細胞Bcl－2、Bax蛋白積分光密度（IOD）的比較（±s）

表2 各組大鼠結腸上皮細胞Bcl－2、Bax蛋白積分光密度（IOD）的比較（±s）

注：與空白對照組比較，△P＜0.05，▲P＜0.01；與模型對照組比較，◇P＜0.05，◆P＜0.01；與雌激素組比較，○P ＜0.05，●P ＜0.01；與大劑量組比較，☆P ＜0.05，★P ＜0.01

－－ 12535.62±892.31 10015.58±895.21模型對照組 －－ 5043.52±873.17▲ 20153.85±971.86▲雌激素組 0.125mg 7614.57±874.12◆ 17471.16±852.47◆歸腎育宮湯大劑量組 70g 10931.19±941.56◆● 13745.45±837.64◆●歸腎育宮湯中劑量組 35g 9635.26±825.38◆● 13861.32±825.36◆●歸腎育宮湯小劑量組 17.5g 7032.12±802.31◆★ 17985.42±887.56 Bax空白對照組組 別 劑量（kg·d） Bcl－2◆★

4 討 論 細胞凋亡是指在一定的生理或病理條件下，細胞接受機體刺激信號后出現的一種主動的、受凋亡相關基因控制的細胞程序性死亡。卵泡顆粒細胞是維持卵巢功能的主要細胞，卵泡數量的多少與卵泡顆粒細胞密切相關，卵泡顆粒細胞的增殖和分化是卵泡不斷發育至成熟的基本條件，卵泡顆粒細胞還是是雌激素、孕激素的重要來源，因此它的凋亡引起卵泡數量減少，激素水平降低并最終導致卵巢早衰的發生［6］。研究表明，卵巢早衰婦女卵泡數量急劇減少，不能分泌足夠的激素及生長因子并伴有顯著的卵泡數量減少，最終導致卵巢早衰。Bcl－2和Bax蛋白在誘導凋亡的線粒體信號傳導途徑中起著重要的作用，Bcl－2蛋白是細胞凋亡的抑制基因，Bax是Bcl－2的同源蛋白，是一種凋亡誘導基因。Bcl－2和Bax蛋白是抑制細胞凋亡的重要靶蛋白。歸腎育宮湯是臨床治療卵巢早衰療效確切的方劑，為明確該方是否能通過影響卵巢顆粒細胞凋亡對卵巢早衰發揮治療作用，本實驗采用ZP3溶液多點注射的方式成功復制了POF小鼠動物模型，模型成功后可見卵泡顆粒細胞凋亡的明顯增多，經給藥治療后，可見歸腎育宮湯大、中、小劑量組小鼠卵泡顆粒細胞凋亡顯著減少，與雌激素組比較發現歸腎育宮湯大、中劑量組藥物療效優于雌激素，表明歸腎育宮湯能有效抑制卵泡顆粒細胞凋亡對POF起到治療作用。通過對Bcl－2和Bax蛋白檢測表明，歸腎育宮湯抑制卵泡顆粒細胞凋亡的作用機制主要與Bcl－2和Bax蛋白的表達有關。

［1］ 劉震坤，金 影，董克勤，等.卵巢早衰實驗研究進展［J］.吉林中醫藥，2013，33（7）：754－755.

［2］ 葉 娜，董曉英，李冬華.卵巢早衰的顆粒細胞凋亡機制研究進展［J］.首都醫科大學學報，2014，35（3）：379－383.

［3］ 任潔寧，楊鑒冰.楊鑒冰教授治療卵巢早衰用藥經驗介紹［J］.現代中醫藥，2009，25（3）：1－2.

［4］ 楊鑒冰.補腎育宮湯配合西藥治療卵巢早衰22例［J］.陜西中醫，2009，30（7）：773－774.

［5］ 符小航，連李斌，康汝光，等.歸腎育宮湯對免疫性卵巢早衰小鼠外周血清性激素的影響［J］.陜西中醫，2014，35（10）：1428－1429.

［6］ 李亞麗，楚 偉，王方娜.何首烏飲對衰老大鼠卵巢組織凋亡相關蛋白 Bax／Bcl－2及 Caspase－3表達的影響［J］.中國新藥雜志，2011，20（18）：1791－1794.