女貞子對大鼠肝組織DAPK基因mRNA表達量的影響*

★ 嵇琴 朱衛豐 張敏 孫振 章明 彭淑紅（.江西中醫藥大學現代中藥制劑教育部重點實驗室 南昌330004；.江西中醫藥大學生命科學學院 南昌330004；3.江西中醫藥大學中醫基礎理論分化發展研究中心 南昌330004）

女貞子為木犀科植物女貞（Ligustum lucidum Ait）的干燥成熟果實。其性涼。《本草綱目》記載具有養陰氣，平肝火的作用。很多研究結果都表明寒涼藥能抑制能量代謝[1-3]。線粒體是機體能量代謝的主要部位，是能量ATP的生成、利用及產熱作用發揮的主要場所。死亡相關蛋白激酶（death-associated protein kinase，DAPK）基因在線粒體中作為一種線粒體膜電位（Δψm）的傳感器存在，線粒體呼吸鏈抑制將導致膜電位減少，進而誘導DAPK激活和DAPK脫磷酸化[4]。DAPK是1995年由Kimchi及其同事在研究功能性基因克隆中首先發現的[5]。近年來，很多學者對DAPK相關進行了較廣泛的研究，但沒有取得突破性進展。本課題旨在研究DAPK的mRNA表達情況，試探找出女貞子降低能量代謝的作用機制，從而更好指導中藥的臨床運用，進一步為藥性的科學評價奠定基礎，也可對疾病發生的可能性及危害做出預測，以作出早期的預防和指導治療。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑 女貞子購自江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司，產品批號均為：1307007，產于江西。經江西中醫藥大學鄧可眾副教授鑒定。RNA保護液購自天根生化科技有限公司（批號：M1705）；RNA提取試劑盒購自Promega公司（批號：20130601）；反轉錄試劑盒購自Promega公司（批號：000096365）；熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司（批號：AK2901）。所用引物通過引物設計軟件oligo 6自行設計，序列如下：內參基因β-actin參照GenBank基因序列（NM_031144）設計，上游引物5’CCCATCTATGAGGGTTACGC3’，下游引物5’TTTAATGTCACGCACGATTTC 3’。DAPK基因參照GenBank基因序列（XM_006253523.1）設計，上游引物：5’AAG ACT GCGGAA GGA CAC 3’，下游引物：5’TAA CAGCCC ACA CTTGAGAG 3’。均由上海生工合成。

1.2 藥物制備 藥物水提液由本實驗室制備。取女貞子藥材1.2 kg加入10倍量水，浸泡60 min，于煎藥壺中煎藥60 min，倒出藥液，殘渣再加入8倍水，煎煮60 min。合并2次藥液，濾過、濃縮后制成含生藥量2.9 kg·L-1）（用藥前稀釋），-20℃放置備用。

1.3 動物 SD大鼠，雄性，200-250g，湖南斯萊克景達實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（相）2011-0003。給予大鼠標準飼料和飲用水。

1.4 儀器SpectraMax Plus384全波長酶標儀、全自動樣品快速研磨儀（上海凈信科技，Tissuelyser-24）高速低溫離心機（德國SIGMA公司SIGMA3-18K）、熒光定量PCR儀（ABI stepone plus）、電熱恒溫水浴鍋、微量移液器（Eppendorf）、渦旋混勻器、千分之一電子秤。

1.5 動物分組與給藥 大鼠30只，隨機分為三組，即空白對照組、女貞子低劑量組、女貞子高劑量組，每組10只。各組動物適應性喂養3天后開始灌胃給藥，灌胃容積為10mL·kg-1，每日1次，共給藥30d。每天給藥劑量：女貞子低劑量2g生藥·kg-1，女貞子高劑量6g生藥·kg-1，空白組給予等容量的蒸餾水。

1.6 試驗取材 第31天將大鼠麻醉，取出肝臟后迅速按照順序分成若干份，提RNA的組織裝入RNA保護液中，其余組織分別用錫箔紙包好，迅速放入液氮中，然后轉移至-80℃冰箱保存備用。

1.7 SYBR Green實時定量PCR檢測DAPK基因的表達[6]

1.7.1 mRNA提取及反轉錄 取肝臟組織約30～100mg按照Promega RNA提取試劑盒說明書步驟提取總RNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，全波長酶標儀測定RNA的純度和濃度。所提取的RNA-70℃儲存備用。按反轉錄試劑盒說明進行cDNA合成。

1.7.2 DAPK和β-actin擴增效率的檢測 首先參照Kenneth的方法[1]，取一份反轉錄好的肝臟cDNA樣品，分別稀釋至100倍、50倍、20倍、10倍、5倍、2倍、1倍。測定每一個稀釋倍數下的ΔCT=（CT，target gene-CT，β-actin），然后這些數據經過最小二乘法線性回歸分析。

1.7.3 DAPK mRNA的檢測 取待測樣品的cDNA，按照熒光定量PCR試劑盒說明書進行操作。反應總體積20μL，cDNA為1～2μg，上游引物終濃度為0.5 μM，下游引物終濃度為0.5μM。反應條件為：95℃1 min，95℃15 s及60℃60 s，共40個循環。最后做溶解曲線，以確定擴增產物的特異性。所有樣品均重復檢測3次，用2-ΔΔCT方法來表示所檢測樣品相對于作為參照因子樣品的目的基因的表達倍數。ΔΔCT=（CT，目的樣本target gene-CT，目的β-actin）-（CT，參照樣本target gene-CT，參照樣本β-actin）。

1.8 統計學方法 采用SPSS16.0進行統計分析。資料經過方差齊性檢驗，數據用均數±標準差表示。藥物組與對照組間的差異比較用獨立樣本的t檢驗法。

2 結果

對大鼠肝臟DAPK mRNA表達的影響，與空白組比較，女貞子低劑量組增加了6.4%，無明顯統計學意義；女貞子高劑量組增加了91.8%，達到了顯著水平（P<0.05）。

3 討論

本文選擇了寒性中藥女貞子研究其對肝臟DAPK基因mRNA表達量的影響。中藥給藥劑量均參考藥典劑量范圍，DAPK是鈣調蛋白調節的絲氨酸/蘇氨酸激酶，檢測mRNA表達水平是判斷組織表達該基因水平的重要手段之一。mRNA是連接基因與表達產物的橋梁。基因活化的直接結果是mRNA轉錄增加，而蛋白質的合成有賴于mRNA的翻譯，即一種蛋白質分子表達的調控從大體上來講可分為轉錄水平和翻譯水平。本試驗采用Real time-PCR方法分析了女貞子對肝臟組織中DAPK基因mRNA表達的影響。

線粒體呼吸鏈抑制劑和解偶聯劑可以減少線粒體膜電位導致DAPK脫磷酸化和激活，由于DAPK在線粒體中作為一種線粒體膜電位（Δψm）的傳感器存在，膜電位減少，DAPK被激活[4]，則其很有可能是通過調節線粒體內膜兩側的電位梯度差，從而影響氧化磷酸化過程。DAPK在正常生理條件下是不活躍的，在本試驗中，寒性中藥不同劑量女貞不同程度的促進了肝臟DAPK表達量，提示女貞可能通過不同程度的影響膜電位差而促進了DAPK的表達，從而影響了氧化磷酸化而達到抑制能量代謝的作用，這與文獻報道寒性藥物長期給藥后動物產熱減少，體溫下降也是一致的[7]。

［1］黃麗萍，彭淑紅，蒙曉芳，等.6種寒性中藥對大鼠肝臟能量代謝的影響［J］.中國中藥雜志，2009，34（24）：3 255-3 258.

表1 女貞子對大鼠肝臟DAPK mRNA表達量的影響

［2］彭淑紅，黃麗萍，高小恒，等.寒性中藥對大鼠骨骼肌能量代謝相關因子的影響［J］.中國中藥雜志，2009，34（23）：3 064-3 067.

［3］丁安榮，李淑莉，王奇志.大黃、梔子對小鼠紅細胞膜Na~+、K~+-ATP酶活性的影響［J］.中國中藥雜志，1990，15（1）：52-57.

［4］Tiesong SS，Joseph J，Hillard CJ，et al.Death-associated protein kinase as a sensor of mitochondrial membrane potential：role of lysosomein mitochondrial toxin-induced cell death［J］.JBiol Chem，2005.280（41）：34 644-34 653.

［5］謝海，仇小強，余紅平，等.5-氮雜-2’-脫氧胞苷對人肝癌細胞株SMMC7721增殖及DAPKmRNA表達的影響［J］.廣西醫科大學學報，2012，29（1）：13-16.

［6］Marcel Kramer，Oliver Backhaus，Philip Rosenstiel，et al.，Analysis of relative gene dosage and expression differences of the paralogs RABL2A and RABL2B by Pyrosequencin g［J］.Gene，2010，455（1-2）：1-7.

［7］陳小野，周永生，樊雅莉，等.大鼠虛寒證模型的研制［J］.中國實驗動物學報，2001，9（3）：29-33.