腺嘌呤致慢性腎功能衰竭大鼠CTGF、FN的實驗研究

★ 閆淵 馬曉燕 崔崢 (遼寧中醫藥大學附屬醫院中醫內科教研室 沈陽110032)

慢性腎衰竭(chronic renal failure CRF)為各種慢性腎臟病持續進展的共同結局。它是以代謝產物潴留，水、電解質及酸堿代謝失衡和全身各系統癥狀為表現的一種臨床綜合征［1］。腺嘌呤大鼠腎衰模型雖然早已用于CRF的研究當中，但是仍很少有從結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)和纖維蛋白(fibronectin FN)的角度來探討其作用機理，而CTGF、FN及其相關研究已經成為目前防治臟器纖維化的熱點。因此如以CTGF和FN為切入點，觀察其在CRF大鼠中的表達分布，將為腎纖維化的病理研究和防治提供新的思路。

1 材料與方法

1．1 主要藥物及試劑 腺嘌呤25g/瓶，美國Amresco公司生產;兔抗大鼠CTGF、FN、SABC法免疫組化試劑盒，購自武漢博士德。

1．2 動物模型建立及分組 SPF級SD雄性大鼠40只(體重180±20g)，由遼寧長生生物技術有限公司提供，動物合格證號:SCXK(遼)2010－0001。按體重層次隨機抽取20只為正常組，余下大鼠為模型組。各組大鼠適應性飼養1周后，模型組按每只大鼠200mg/(kg·d)的腺嘌呤灌胃［2］，每日1次，正常組以等量NaCl溶液灌胃，連續灌胃4周，在造模期間因灌胃手法不當，誤傷肺組織而導致正常組大鼠死亡1只，腺嘌呤組大鼠死亡2只。

1．3 標本收集 各組大鼠分別于第4周后處死，10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血化驗腎功能;全自動生化分析儀檢測血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN);取左側部分腎組織用4%多聚甲醛固定，其余腎組織分別置于PC管中，液氮保存。腎組織經4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片(厚度為4～5μm)后常規HE染色，OLMPUS顯微鏡觀察各組腎組織病理變化并拍照。

1．4 免疫組織化學法檢測CTGF、FN的表達 免疫組化SABC法染色，一抗用兔抗大鼠CTGF、FN抗體，二抗用相應羊抗鼠抗體(工作濃度按產品說明書配制為1∶100)染色呈棕褐色或棕黃色者為陽性染色，OLMPUS顯微鏡觀察每張切片并隨機選取5個視野，用捷達801圖像分析系統進行圖像分析，檢測視野內免疫陽性細胞的平均灰度值，測得組織細胞平均灰度值愈小，其蛋白水平愈高。

1．5 統計學方法 計量資料用(ˉx±s)表示，應用SPSS17．0軟件中的t檢驗進行統計分析。P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 兩組大鼠腎組織HE染色結果 在10倍鏡下觀察兩組大鼠腎組織的病理學改變，正常組的腎臟皮質，腎小球結構、形態、大小，血管球與腎小球囊腔的比例正常，髓質，近端小管與遠端小管的管壁薄厚、管腔大小正常，無炎性細胞浸潤。模型組的腎臟皮質，腎小球結構、形態、大小不正常，血管球萎縮、腎小球囊腔變大，比例失調，近端小管與遠端小管的管壁薄厚不勻、腫脹，管腔大小不一，有大量的炎性細胞浸潤。見圖1。

表1 各組大鼠SCr、BUN檢測結果(ˉx±s)

表2 各組大鼠CTGF、FN水平的比較(ˉx±s)

圖1 各組大鼠腎組織HE染色

圖2 各組大鼠CTGF表達

圖3 各組大鼠FN表達

2．2 各組實驗大鼠血清Scr及BUN的比較 在造模后4周，腺嘌呤組的SCr和BUN明顯升高，與正常組比較腺嘌呤組的SCr、BUN差異有統計學意義(P＜0．01)。詳見表1。

2．3 兩組大鼠CTGF、FN的表達 造模4周后，正常組CTGF、FN表達不明顯，而腺嘌呤組腎小管上皮細胞胞漿和胞核中CTGF、FN表達增加(P＜0.01)。細胞中有棕黃色顆粒者為陽性細胞表達(見表2，圖2、3)。

3 討論

用腺嘌呤灌胃的大鼠腎衰竭模型，我國主要用于CRF及腎間質纖維化的研究。周小舟等［3］通過觀察灌胃21d后大鼠的SCr、BUN、血漿總蛋白、腎比重、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化酶等指標提出腺嘌呤大鼠CRF的機理可能為其代謝產物尿酸結晶刺激、阻塞而損傷腎小管及間質導致其功能減退;耿靜［4］通過復制鄭平東教授的慢性腎衰模型，并通過測定SCr、BUN及24h尿蛋白定量和顯微鏡觀察腎組織的病理變化，進一步證實腺嘌呤按體重灌胃給藥可達到CRF的造模要求并且結果穩定、可控，為臨床常用一些溫補腎陽之品治療CRF患者提供了理論依據。因此本實驗采用腺嘌呤腎病模型，造模4周后模型組SCr、BUN明顯升高，差異有統計學意義(P＜0．01)，肉眼可見似人類的“大白腎”，由此可知腺嘌呤已成功復制出CRF大鼠腎衰竭模型。現研究表明CTGF作為轉化生長因子TGF－β1的下游反應元件，在腎纖維化中起到很大的作用，尤其是在原位雜交的結果中發現，正常腎組織中僅有少量CTGFmRNA表達。在一些伴有細胞增殖、基質沉積的腎小球炎癥及小管間質損傷疾病中，CTGFmRNA表達明顯增高，更加證明了CTGF在腎纖維化病程中的作用［5－6］。FN是一種具有較強細胞粘附活性的高分子糖蛋白，在正常腎組織中主要分布于腎小球系膜區，是腎組織內的固有成分。在腎硬化的研究中，國內外學者皆發現ECM的各種成分中以FN的反應最為迅速而持久，先于膠原W、膠原V和層粘連蛋白。如張月娥［7］的研究表明，在腎小球炎癥早期FN迅速出現，中、后期亦維持高水平，后期W型膠原才明顯增多，提示FN是一種始動因素，局部FN和膠原的堆積及其強烈的化學趨化性，是導致成纖維細胞、腎小球系膜細胞、內皮細胞增殖及腎小球硬化形成的重要基礎。FN的增多是膠原蛋白沉積的必要條件，FN的持續增加，加快了腎臟纖維化和硬化的速度。本實驗中腺嘌呤組的CTGF、FN的表達明顯增加(P＜0．01)，提示腺嘌呤灌胃制作的大鼠腎衰模型是通過CTGF和FN的表達而實現，從而為中醫藥治療CRF提供新靶點。

［1］陳灝珠，鐘南山，陸再英．內科學［M］．北京:人民衛生出版社，2014:524－532．

［2］鄭平東，朱燕俐，丁名城，等．用腺嘌呤制作慢性腎功能衰竭動物模型［J］．中華腎臟病雜志，1989，5(6):342－344．

［3］周小舟．腺嘌呤所致大鼠慢性腎功能衰竭的機理研究［J］．基礎醫學與臨床，1997，2(17):54－57．

［4］耿靜．腺嘌呤所致大鼠慢性腎功能衰竭的實驗研究［J］．河南中醫學院學報，2008，3(23):24－25．

［5］MurphyM，GodsonC，CanonS，et al．Suppression subtractive hybridization identifies high glucose levels as a stimulus for expression of connective tissue growth factor and other genes in human mesangial Cells［J］．Biol Chem，1999，274:5 830．

［6］WahabNA，Yevdokimova N，Weston BS，et al．Role of connective tissue growth Factor in the pathogensis of diabetic nephropathy［J］．Bioehem J，2001，359:77．

［7］張月娥．纖維連接蛋白在腎小球硬化過程中的演變情況觀察［J］．中華病理雜志，1987，16(1):36．