結核性胸積液腺苷脫氨酶2活性及免疫組化研究*

李方知 黃廣雄 盧峰岳

胸積液中腺苷脫氨酶（ADA） 活性升高是診斷結核性胸積液重要的輔助指標之一。ADA有2 種同工酶：ADA1和ADA2。結核性胸積液ADA活性的升高主要是由ADA同工酶ADA2增高所致，所以ADA2檢測在結核性胸積液的診斷有重要作用[1]。Ungerer等[2]檢測正常人全身細胞，發現僅單核巨噬細胞有ADA2。本研究通過檢測結核性胸腔積液總ADA 和ADA2活性，并用免疫組化方法檢測ADA2在結核性胸積液胸膜組織細胞中的細胞分布，以進一步了解ADA2的細胞來源和其在結核性胸積液中的作用機理。

1 資料與方法

1.1 一般資料 32例本院結核性胸積液患者，經細菌學或病理活檢確診，胸積液性質為滲出液。

1.2 方法 紅-9-（2-羥基-3-壬烷基）腺嘌呤（EHNA）能完全抑制ADA1活性，但不能抑制ADA2活性，參照Muraoka等[3]使用的方法，將每份胸積液標本分成2管，第一管直接測量ADA活性，即為總ADA（ADA1＋ADA2），第二管加入EHNA后測量所得的ADA活性為ADA2活性，采用邁克公司腺苷脫氨酶（ADA）檢測試劑盒，羅氏P80自動生化儀測定；ADA2（也稱為CECR1）兔抗人多克隆抗體購自Sigma公司，巨噬細胞表面標志物CD68兔抗人多克隆抗體購自博士德公司，辣根過氧化酶標記Envision二步法二抗，購自Dako公司。以免疫組化（Envision二步法）作結核性胸積液胸膜組織的ADA2和巨噬細胞表面標志物CD68的免疫組化：同一蠟塊組織以3 μm間距連切兩份，一份以ADA2抗體為一抗工作液作實驗對象，另一份以巨噬細胞表面標志物CD68抗體代替ADA2抗體作為一抗的免疫組化為陽性對照。

1.3 陽性判斷標準 實驗結果判定以胞質內和胞膜上出現棕黃色顆粒為陽性。用PBS代替ADA2抗體作為一抗的免疫組化為陰性對照。CD68抗體代替ADA2抗體作為一抗的免疫組化為陽性對照。

1.4 統計學處理 采用SPSS 17.0統計學軟件進行統計學處理，計量資料以（x-±s）表示，比較采用t檢驗，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者ADA1與ADA2情況比較 患者結核性胸積液中總ADA 為（51.88±23.02）U/L，ADA1為（13.04±7.94）U/L，ADA2為（38.84±18.71），ADA2活性占總 ADA的 74.8%，ADA2活性高于ADA1，差異有統計學意義(t=8.48，P<0.01)。

圖2 胸膜結核ADA2免疫組化（×100）注：黑箭頭所指為朗格漢斯巨細胞

圖1 胸膜結核的ADA2免疫組化（×200）注：黑箭頭所指為朗格漢斯巨細胞，白箭頭所指為上皮樣細胞

2.2 結核性胸積液活檢的胸膜組織免疫組化結果 PBS代替一抗（ADA2抗體）免疫組化的陰性對照，顯示胸膜組織的各種細胞無棕黃色顆粒沉著。結核性胸積液胸膜組織的ADA2免疫組化（圖1），可見巨噬細胞、朗格漢斯巨細胞和上皮樣細胞被深染，胞漿和胞膜有大量的棕黃色沉著，淋巴細胞、成纖維細胞和其他細胞無棕黃色沉著；結核性胸積液胸膜組織的ADA2（圖2）和巨噬細胞表面標志物CD68（圖3）的免疫組化均可見巨噬細胞、朗格漢斯巨細胞和上皮樣細胞被深染，胞漿和胞膜有大量的棕黃色沉著，其他細胞無棕黃色沉著。圖2和圖3的染色效果相似。

圖3 胸膜結核CD68免疫組化（×100）注：黑箭頭所指為朗格漢斯巨細胞

3 討論

本研究顯示結核性胸腔積液總ADA活性中，ADA2平均占74.8%，其總ADA活性主要是由ADA2所構成，提示結核性胸腔積液總ADA活性升高主要由ADA2所致。胸膜組織ADA2免疫組化結果和巨噬細胞表面標志物CD68免疫組化結果相似，巨噬細胞、朗格漢斯巨細胞和上皮樣細胞被深染棕黃色，顯示ADA2來源于巨噬細胞、上皮樣細胞和朗格漢斯巨細胞。結核性炎癥滲出的細胞常以單核細胞為主，單核細胞經血管進入組織后演變為巨噬細胞，活化的巨噬細胞吞食消化結核分枝桿菌后轉化而成上皮樣細胞，多個上皮樣細胞融合成朗格漢斯巨細胞，而結核菌的菌體脂質促使巨噬細胞轉變成上皮樣細胞和朗格漢斯巨細胞，所以這些細胞都屬同一細胞來源[4]。Zavialov等[5]報道單核細胞轉化為巨噬細胞時會產生ADA；而在炎癥反應時，巨噬細胞能分泌AD。

2ADA2能誘導單核細胞分化成巨噬細胞，并且使巨噬細胞和CD4+T細胞增殖，另一種同功酶ADA1則不能誘導單核細胞分化成巨噬細胞，在結核性胸積液中含有大量的巨噬細胞和CD4+T細胞[7]，宿主抗結核免疫主要是通過以T淋巴細胞介導、巨噬細胞為效應的細胞免疫反應，所以ADA2使巨噬細胞和CD4+T細胞增殖的作用可能有利于機體抗結核。結核性胸積液ADA2活性升高主要是由于宿主單核巨噬細胞、上皮樣細胞、朗格漢斯巨細胞等和結核菌相互作用的結果。

綜上所述，結核性胸積液的ADA活性主要由ADA2構成，ADA2源自巨噬細胞、上皮樣細胞和朗格漢斯巨細胞。

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