綜合康復對大鼠受壓坐骨神經微血管生成的影響*

張珊珊 杜震生 陳峰 蘇寧

目前，隨著人民生活質量意識提高，周圍神經損傷后恢復日益受到重視。雖然顯微外科手術可以解除周圍神經卡壓，但如何保護卡壓神經，最大限度地減輕繼發性損害，重建神經傳導，當前還無法很好解決。近年來，運用物理療法治療周圍神經損傷已有報道[1-4]，但治療機制仍不清楚，基于此，本課題采用經典Mackinnon[5]大鼠坐骨神經卡壓模型，采用康復訓練聯合針刺療法，通過對卡壓神經CD34、VEGF表達檢測以及坐骨神經功能指數檢測，分析、揭示康復訓練聯合針刺療法對卡壓周圍神經微血管生成及功能修復的作用機制，為臨床從神經微循環角度治療神經損傷提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用雄性清潔級SD大鼠46只（由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供），體質量230~250 g。

1.2 主要試劑 小鼠抗大鼠VEGF單抗：武漢博士德生物技術有限公司。SABC免疫組化染色試劑盒：武漢博士德生物技術有限公司。兔抗大鼠CD34多克隆抗體：武漢博士德生物技術有限公司。

DAB顯色試劑盒：武漢博士德生物技術有限公司。

1.3 主要儀器設備 顯微手術器械：浙江寧波市成和顯微器械廠；醫用硅膠管：上海橡膠制品五廠；FS3013德國目樂顯微鏡：德國麥迪塞姆儀器有限公司；圖像采集系統，Image Pro Pluss 5.01；G6805型電針儀：上海醫療器械高科技公司。

1.4 動物模型制作 動物模型參照經典Mackinnon大鼠坐骨神經卡壓模型制作。模型實驗動物于同一動物飼養室適宜環境下適應性飼養1周。在梨狀肌下緣10 mm處，將內徑1.0 mm、長6.0 mm的一段硅膠管縱向切開后套在這段坐骨神經上，以7/0無創線在8倍手術顯微鏡下縫合硅膠管3針。術后2周，隨機選6只，沿原切口打開，卡壓段神經經病理學證實為中、重度脫髓鞘改變，則造模成功。造模成功后，其余40只大鼠僅去除硅膠管，卡壓段神經外膜不加以松解。

1.5 動物分組 動物模型隨機等分為4組（n=10）。A組（對照組）：僅去除卡壓；B組（康復訓練組）：去除卡壓后行康復訓練；C組（電針組）：去除卡壓后行電針治療；D組（康復訓練+電針組）：去除卡壓后行康復訓練加電針治療。

1.6 治療方法

1.6.1 康復訓練 手術結束后第2周開始康復訓練，訓練項目為游泳，每天1次，第1天10 min，每天增加3 min，直到手術結束后第3周增至30 min，之后不再增加維持至實驗結束取材為止。

1.6.2 電針治療 電針治療于去除卡壓術后第2天開始，在支架上固定，按實驗針灸學穴位定位，電針正極接在近心端，負極接在遠心端。分別夾在“足三里”和“環跳”穴處的針柄上。用華佗牌0.25 mm、13 mm的針灸針進針6 mm，針灸方法為電針，采用G6805型電針儀，雙向規律電脈沖，寬度0.5 ms，頻率2 Hz，穴位周圍組織達到輕度顫抖即可。治療時間為20 min，每天1次，維持至手術結束后第3周實驗結束。

1.7 觀察項目

1.7.1 整體狀態 解除卡壓手術結束后觀測大鼠的肢體、傷口恢復情況。

1.7.2 坐骨神經功能指數（Sciatic nerve function index，SFI）測評 參照沈寧江等[6]的方法，正常：SFI=0；完全損傷：-100；不完全損傷：-100至0。測量時間為去除卡壓手術結束后第22天。

1.7.3 CD34、VEGF檢測 取卡壓神經中段標本石蠟切片，采用免疫組化染色，用以判定CD34、VEGF免疫組化水平表達程度。CD34、VEGF染色成棕黃色至深棕色為陽性，神經微血管密度（MVD）計算參照Weidner[7]方法。

1.8 統計學處理 數據均錄入SPSS 18.0軟件完成統計分析。所有計量資料均先進行單樣本K-S正態分布檢驗及方差齊性檢驗，屬正態分布且方差齊的多組獨立樣本比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），如屬于非正態分布或方差不齊的多組獨立樣本比較進行非參數檢驗（秩和檢驗）中K個獨立樣本檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 整體狀態 兩組大鼠均少數出現右爪皮膚潰瘍，但D組潰瘍愈合程度好于B組與C組，A組愈合程度最差；肌肉萎縮方面，D組肌肉萎縮程度低于B組與C組，A組肌肉萎縮最明顯；打開切口均可見神經卡壓處變細，質地變硬，與周圍組織粘連，卡壓處兩端增粗，但D組好于B組與C組，A組最差。

2.2 各組大鼠坐骨神經功能指數（SFI）測評比較 B、C、D組SFI恢復程度均大于A組，差異均有統計學意義（P<0.05）；D組SFI恢復程度明顯大于B組與C組，差異均有統計學意義（P<0.05），見表1。

2.3 各組大鼠CD34檢測比較 B、C、D組再生神經微血管數量明顯高于A組，差異均有統計學意義（P<0.05）；D組再生神經微血管數量明顯高于B組與C組，差異均有統計學意義（P<0.05），見表1。

2.4 各組血管內皮生長因子（VEGF）檢測比較 B、C、D組VEGF表達明顯高于A組，差異均有統計學意義（P<0.05）；D組VEGF表達明顯高于B組與C組，差異均有統計學意義（P<0.05），見表1。

表1 各組大鼠SFI比較（±s）

表1 各組大鼠SFI比較（±s）

*與A組比較，P<0.05；△與B組比較，P<0.05；﹟與C組比較，P<0.05

組別 SFI CD34 VEGF A組（n=10） -28.74±4.00 27.99±3.92 25.64±3.94 B組（n=10） -21.27±3.80* 33.65±3.04* 32.49±4.43*C組（n=10） -21.58±3.65* 32.16±3.50* 30.39±4.48*D 組（n=10） -15.93±2.68*△﹟ 37.39±4.54*△﹟ 39.12±4.46*△﹟

3 討論

CD34是一種跨膜細胞表面糖蛋白，是小血管內皮細胞、內皮細胞祖細胞和造血祖細胞表面的標志[8]，常用CD34標記新生血管，因其抗體是毛細血管的內皮細胞標記物[9]。

血管內皮生長因子（VEGF）是一種作用較強的血管生成因子和高度特異的促血管內皮有絲分裂因子，同時還是神經營養因子。Gupta等[10]發現慢性受壓神經內血管內皮生長因子及其受體蛋白增多，神經內血管數目會同時上升。在缺血性損傷情況下，Wang等[11]與Zachary[12]研究表明VEGF能夠大幅提高血管再生。

血液供應是神經再生與功能恢復的前提，眾所周知，運動訓練可改善血液供應，進而促進了神經再生與恢復[13-16]。大鼠運動療法本實驗采用游泳訓練。一方面，水靜壓可以消除腫脹，促進肌肉恢復，進而促進靶器官神經功能。另一方面，浮力作用可使身體負荷減輕，從而減輕腿部疼痛，使運動變得更容易，更增強了運動療效。多項研究顯示，在治療周圍神經損傷、促進神經再生、恢復神經功能方面，電針有較明顯優勢[17-20]。

本研究表明綜合康復能夠有效促進大鼠卡壓坐骨神經再生，同時促進神經功能恢復，這可能與神經內微血管再生有關。

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