趨化素樣因子1在血管再狹窄中的作用及體外遷移實驗研究進展

陳 峰，張 韜，郭 偉解放軍總醫院 血管外科，北京 00853；北京大學人民醫院 血管外科，北京 00044

動脈粥樣硬化引起的外周動脈疾病(peripheral arterial disease，PAD)是僅次于冠心病和卒中的最常見的血管疾病，全球70歲以上人群患病率超過了10%[1]。對于PAD患者的管理，目前美國心臟病學學院基金會/美國心臟協會指南推薦的手段主要是基礎治療和手術治療，手術治療借助于動脈旁路移植術、動脈內膜剝脫術、經皮腔內血管成形術/支架置入術[2]。無論哪種手術方法，都存在20%～30%的血管再狹窄(restenosis，RS)并發癥，嚴重影響該病治療的遠期療效[3-4]。RS發生的核心機制之一為炎性細胞和血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)在趨化因子，如趨化素樣因子1(chemokine like factor 1，CKLF1)、單核細胞趨化因子1(macrophage chemoattractant protein 1，MCP-1)、Fractalkine等介導下的遷移[5-7]。CKLF1是北京大學人類疾病基因研究中心應用抑制性減數雜交技術克隆出的一個新細胞因子，與MCP-1在結構上具有同源性[6,8]。體內和體外實驗證實其具有廣譜的趨化活性，而且能夠促進骨骼肌細胞、骨髓造血干/祖細胞的增殖和分化[8-9]，與心血管疾病也存在著密切關聯[10-11]。傳統研究方法發現CKLF1具有誘導VSMC增殖和抗凋亡的雙重作用[12]，還能促進VSMC定向遷移[13]。本文主要介紹CKLF1在RS形成過程中的作用機制，并綜述既往相關的體外遷移研究實驗。

1 CKLF1在RS病程中的作用

近半個世紀以來，對RS機制的探究始終未曾停止。多數研究認為，炎癥損傷和免疫反應貫穿于整個病變過程，血管重建造成了內皮損傷，病變處血管的擴張或全層離斷使中膜彈性纖維層的破壞延伸到外膜，血管壁損傷會導致局部微血栓形成和炎癥反應發生，進而在眾多細胞因子[(MCP-1、巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colonystimulating factor，M-CSF)、γ-干擾素、腫瘤壞死因子-α、血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)]的作用下使VSMC過度增殖，促進細胞外基質增多并同VSMC一起向內膜遷移，最終共同構成了增生的內膜組織，引起了RS的發生[14-20]。

趨化因子是一類調控細胞定向遷移的重要細胞因子，根據結構可以分為C、CC、CXC、CX3C亞族。目前，已發現與RS相關的趨化因子主要包含CC亞族中的MCP-1/MCAF、MIP-1α、MIP-1β，CXC亞族中的PAF、IL-8、GRO以及CX3C家族的Fractalkine等，其受體(XCR1、CCR1 ~ 11、CXCR1 ~ 5和CX3CR1)多屬于G蛋白偶連受體超家族[6-7]。新細胞因子CKLF1具有CC家族趨化因子的特征性結構，通過HEK293細胞實驗發現其受體之一是CCR4[21]。CKLF1不僅能夠趨化嗜中性細胞、單核細胞和淋巴細胞，而且可以刺激小鼠骨骼肌細胞的增殖，以及促進人和小鼠骨髓造血干細胞的增殖和分化[8-9]。有報道稱其還能調控單核細胞向樹突狀細胞的轉化[22]。動物實驗發現，CKLF1可以改善大鼠急性心肌梗死后心臟功能，有助于心肌修復[23]。目前CKLF1與血管疾病關聯的研究較少。筆者之前的研究中[24]推測CKLF1協同基質金屬蛋白酶參與了腹主動脈瘤的發病，氫水治療可以有效阻斷前述病理進程。宣成睿等[13,25]分別發現人CKLF1質粒瞬時轉染的COS7和293T細胞培養上清液對VSMC具有趨化和促增殖作用，且該作用依賴于Gi蛋白偶聯受體。同樣的促增殖和遷移作用也表達在主動脈內皮細胞上，推測CKLF1具有促進新生血管形成的功能[26]。CKLF1與MCP-1在結構上具有同源性，且在大鼠主動脈損傷模型中，發現內膜組織中CKLF1與MCP-1在表達上存在高度正相關性，提示CKLF1在RS過程中可能與MCP-1發揮相似的功能[27]。

在對CKLF1促進VSMC遷移作用的系列研究中，多位研究人員均證實CKLF1參與了VSMC遷移過程，是發生RS的危險因素：1)人動脈硬化斑塊的內皮細胞、VSMC和巨噬細胞皆可表達CKLF1，其表達量較正常動脈顯著上調，斑塊中CKLF1、巨噬細胞和VSMC共定位存在，推測CKLF1在招募炎癥細胞，刺激VSMC遷移等RS關鍵步驟上可能起到了某種特殊的作用[12,28]。2)通過腺病毒和shRNA技術干擾CKLF1基因表達，在體外實驗中發現CKLF1促VSMC遷移功能分別得到增強和減弱，在大鼠頸動脈局部損傷的體內實驗中對應的內膜增生變化趨勢與體外實驗一致[28]。3)通過CKLF1的小分子多肽C19和化合物抑制劑S009阻斷VSMC上的CCR4受體，發現CKLF1引起的作用發生了改變[29]，提示CCR4是CKLF1的受體之一，這一現象與王應和馬大龍[21]的研究結論基本一致。4)VSMC轉染CKLF1后，內含核因子(nuclear factor，NF)-κB的表達總量被增強，推測NF-κB信號通路參與了CKLF1介導VSMC生物學功能的調控[30]。由此可見，CKLF1在RS的發展過程中起了重要作用，遺憾的是，目前CKLF1對VSMC作用機制尚無更深入研究，如受體變化、信號轉導、表型轉化和轉錄因子等層面，因而制約了其藥物拮抗靶點和臨床應用價值的開發利用。

2 體外遷移實驗

在CKLF1對RS發生機制的研究中，VSMC遷移是基本實驗模型。影響VSMC遷移的因素很多，包括各種生長因子、趨化因子、流體應力等。為探索多因素介導VSMC遷移的機制，重復性好、可信度高的體外研究是十分必要的。傳統研究中VSMC遷移主要依賴于劃痕法和細胞趨化小室(Boyden Chamber)等經典技術。前者是在孔板上，當VSMC貼壁長滿時用移液槍頭或刀片刮除一定范圍的細胞，觀察細胞向刮除細胞區的遷移運動。一般以某一細胞群的最大遷移距離為參數分析VSMC遷移能力。該方法操作簡單，直觀，備受實驗人員青睞，但其劃痕速度和尺寸一致性較差。在劃痕過程中，細胞受到機械性損傷，并釋放細胞內容物于周圍環境，且細胞損傷程度不可控，導致遷移過程復雜多樣。另外，瓶皿表面修飾分子層會被劃痕破壞，上述問題說明該技術可重復性較差。后者以8μm孔徑濾膜為分界，將VSMC接種至上層小室，下室加入不同誘導物，于不同時間點取出濾膜擦掉膜正面的細胞后，固定、染色，在顯微鏡下計數膜背面視野中的細胞數，也可以在電鏡下觀察VSMC跨膜的過程。但細胞趨化小室技術只能模擬VSMC在單一濃度、穩態溶液環境中的反應，而體內環境中VSMC遷移是一個多因素調控的復雜病理生理學過程。更為重要的是，相對于血管壁的微小尺寸，這些胞外環境與體內微環境差異十分明顯，客觀上難以真實反映生理狀態下VSMC的生物學特征。因此，需要能更好模擬活體血管壁微環境并具有對活細胞從時間上和空間上進行精確操作的細胞研究裝置。

微流控芯片又稱為“芯片實驗室”，是通過半導體集成技術制成的新型固體元件，可對微量流動細胞進行復雜、精確的操作，該項技術與基因芯片技術并稱為21世紀最有發展前景的新技術。在基于微流控技術的細胞研究領域中，早在2006年《Nature》上就有針對微流控細胞培養芯片的相關綜述：包括芯片材料選擇、建立微環境、片上培養、細胞檢測等[31]。2014年《Nature》上進一步綜述微流控技術在腫瘤細胞、骨細胞、干細胞、內皮細胞等領域的重要應用[32]。在基于微流控技術的細胞遷移研究中，Whitesides最早提出利用微流控技術的層流特性，在微溝道中產生溶液濃度梯度和束縛在襯底上的大分子密度梯度[33-34]。其優勢是梯度定量可控，不僅產生線性梯度而且可以產生穩定多樣的梯度，更好地模擬細胞微環境。使用這一技術，量化了炎癥細胞[35]、腫瘤細胞[36-37]、小腸上皮細胞在不同梯度下的遷移[38]。Wong在Whitesides設計的“圣誕樹”結構基礎上，通過控制交聯劑濃度梯度實現了束縛于襯底表面的硬度梯度[39]。Ladoux使用微流控技術制作微陣列，通過調整微柱的尺寸，同樣實現了襯底表面的硬度梯度[40]。Du等[41-42]化繁為簡，摒棄了傳統微流控技術中的導管和泵，采用滑動芯片法，在微溝道中產生溶液濃度梯度。與傳統方法比較，微流控技術不僅可以“真實”模擬細胞外環境，還能構建細胞級精度的濃度梯度、分子密度梯度、硬度梯度等，成為細胞層面機制研究的優勢平臺。

3 結語

CKLF1在RS的病理過程中具有重要作用，CKLF1調控VSMC遷移過程，是發生RS的危險因素。然而，CKLF1對VSMC的研究尚無深入到受體變化、信號轉導、表型轉化和轉錄因子等層面，現象表征的模型缺陷也制約了VSMC在趨化因子作用下遷移機制的研究，此方面空白亟需填補，以期對RS的治療開拓新的思路和方案，并且基于高通量方法，可以提高體外實驗進行心血管藥物篩選的成功率。

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