直腸癌肝轉移患者接受西妥昔單抗治療后出現K-RAS基因突變的檢測與治療探討

司海燕，王偉蘭，戴廣海

解放軍總醫院 腫瘤內二科，北京 100853

西妥昔單抗是以表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)為作用靶點的嵌合性單抗，為目前常用的分子靶向治療藥物。研究表明，K-RAS基因突變可以導致結直腸癌患者對西妥昔單抗原發性耐藥[1]，因此《美國國立癌癥綜合網絡(NCCN)結直腸癌臨床實踐指南》2008版明確指出，所有轉移性結直腸癌患者都應檢測K-RAS基因狀態，并且只有K-RAS野生型患者才建議接受西妥昔單抗治療。約25%的結直腸癌患者存在K-RAS基因突變，但文獻較少對K-RAS野生型晚期大腸癌患者在接受西妥昔單抗治療期間出現K-RAS基因突變報道。本文報道1例K-RAS野生型直腸癌肝轉移患者在接受43個月西妥昔單抗治療后發生K-RAS突變的病例，并通過相關的文獻探討西妥昔單抗與K-RAS基因發生突變的關系，以了解西妥昔單抗的耐藥機制以及后續克服耐藥的策略。

資料和方法

1 資料 患者女性，70歲，確診直腸癌肝轉移4年余，直腸切除術后3年8個月，肝局部消融治療6個月、雙肺轉移2個月，為行進一步治療于2015年5月9日入院。

2 方法 針對此例K-RAS野生型直腸癌肝轉移患者接受西妥昔單抗治療后出現K-RAS基因突變的臨床資料并文獻復習，進行2011年術后標本基因檢測及2014年肝轉移病灶基因檢測，對比檢測結果并制訂治療方案，觀察及評價治療效果。結果判讀：通過PCR的檢測方法，得出肝轉移病灶K-RAS基因位點61密碼子181C>A Q61K突變的結果。

3 PCR檢測 1)DNA提取：取石蠟包埋標本切片，經二甲苯及梯度乙醇脫蠟，加入蛋白酶K消化，按照操作說明書提取DNA，設計引物：第一外顯子上游引物5'-ACAGCACTCTGGCTATTT-3'，下游引 物5'-TATCAAAGAATGGTCCTG-3'。2)PCR擴增：PCR反應體系(總體系50 μl)包括10×PCR緩沖液，dNTPs 0.2 mmol/L，Taq DNA聚合酶2 U，基因組DNA 100 ng，MgCI21.5 mmol/L，引物各1 μmol/L，反應條件為94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環30次，最后72℃延伸5 min。3)電泳鑒定及陽性PCR產物測序：PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳純化鑒定后，用ABI 3130XL測序儀進行序列分析，測序文件經軟件分析后進行結果判讀。

結 果

1 病理 2011年5月7日患者術前腸鏡活檢病理：(直乙交界)中－高分化腺癌。2011年8月30日腹腔鏡下行直腸癌切除術。術后病理：淺表潰瘍型腺癌，中分化，腫瘤大小1.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，腫瘤侵及肌肉層，上、下切緣均未見癌。2014年10月29日肝轉移病灶穿刺活檢病理：(肝S7段、肝S8段交界近膈病灶)穿刺肝組織內見中分化腺癌浸潤，結合病史考慮結腸癌轉移可能性大。

2 影像學表現 2011年5月腹部超聲示：肝多發低回聲結節，轉移癌可能性大；乙狀結腸管壁增厚，直腸癌可能大。腹部CT：肝內多發轉移瘤。結腸氣鋇雙重造影：乙狀結腸癌。2015年3月腹部MRI：肝新發轉移灶，肺CT：雙肺轉移。

3 手術 2011年8月30日行腹腔鏡下直腸癌切除術。

4 藥物治療 診斷明確后于2011年5 - 7月行5周期西妥昔單抗+奧沙利鉑+亞葉酸鈣+氟尿嘧啶方案術前轉化治療，治療后復查肝轉移病灶較前明顯縮小。于術后9 ~ 12個月行第6 ~ 11周期前述方案化療(第8周期后因經濟因素停用靶向藥物)，2012年2月- 2013年4月行第12 ~ 29周期卡培他濱維持治療。2013年7月- 2014年5月因肝病灶增大更換為FOLFIRI、5-Fu、伊立替康方案＋西妥昔單抗靶向治療。2014年5 - 12月給予西妥昔單抗維持治療，后因肝轉移灶病理提示K-RAS基因突變停用西妥昔單抗。2014年10月復查肝病灶增大，2014年10月29日行“彩超引導下肝S7、S8段交界近膈病灶穿刺活檢手術+肝病灶消融治療”。2014年11月3日彩超引導下行第2次“肝病灶消融治療”。2015年3月因肝新發病灶、雙肺轉移更換為貝伐珠單抗+奧沙利鉑方案治療4周期。

5 基因檢測 2011年5月腸鏡活檢標本基因檢測：EGFR、K-RAS未見突變；2014年12月31日術后標本補查K-RAS基因檢測未見突變；2014年10月29日肝轉移病灶穿刺活檢標本基因檢測：K-RAS 61密碼子181C＞A Q61K基因位點突變，B-RAF、N-RAS未見突變。

6 療效評價 通過病理科將手術標本與肝轉移病灶穿刺標本進行RAS基因檢測，得出接受西妥昔單抗治療后出現K-RAS基因突變及一線治療無進展生存時間(progression free survival，PFS)43個月，二線治療PFS 2個月的結果，PFS顯著延長，病情得到有效控制。

討 論

西妥昔單抗是抑制腫瘤細胞EGFR的IgG1單克隆抗體，以比自然配體更高的親和力與EGFR結合，從而抑制自然配體與EGFR的結合，導致細胞表面受體及受體信號傳導下調。K-RAS基因突變是最常見的大腸癌相關基因改變之一。當K-RAS基因呈突變狀態時RAS蛋白持續活化，即使阻斷上游EGFR也無法調控下游事件的發生，因此腫瘤會持續生長、增殖甚至轉移。故一旦K-RAS基因突變，即可導致腫瘤對EGFR單抗耐藥[2-3]。因此，K-RAS基因突變型的結直腸癌患者不能從西妥昔單抗治療中獲益，而K-RAS野生型患者可以從西妥昔單抗治療中獲益。本例患者原發灶檢測為K-RAS野生型，應用西妥昔單抗治療3年余，證實該患者確實從西妥昔單抗的治療中獲益。

研究表明，EGFR抑制劑耐藥分為原發性耐藥和繼發性耐藥。原發性耐藥機制包括細胞內參與EGFR信號轉導通路的K-RAS、NRAS、BRAF、PIK3CA、ERBB2、MET基因的突變，PTEN蛋白表達的缺失等[4-6]。繼發性耐藥機制大概劃分為二類：第一類是破壞了西妥昔單抗和EGFR連接的基因突變，如EGFR胞外域S492R的基因突變；第二類是繞過EGFR激活其下游信號途徑，如K-RAS或BRAF基因突變，MET或ERBB2的基因擴增等。研究顯示，EGFR抑制劑西妥昔單抗治療轉移性結直腸癌(metastaticcolorectalcancer，mCRC)導致了繼發性耐藥。EGFR胞外域S492R的基因突變在未治療的CRC患者中沒有發現過，只在應用過西妥昔單抗治療的患者生物樣本中發現，也許是西妥昔單抗誘導了耐藥[7]。另有報道，西妥昔單抗的使用誘導了K-RAS基因的突變，導致繼發性耐藥[8-10]。由于腫瘤的異質性，腸癌肝轉移患者腫瘤組織中大部分表現為K-RAS野生型細胞，同時有極少量的K-RAS基因突變細胞。西妥昔單抗使K-RAS野生型的細胞被殺死，K-RAS基因突變的細胞不斷生長引起繼發性耐藥。而化療藥物通常不會導致K-RAS基因發生突變。本例患者在西妥昔單抗應用43個月后出現K-RAS基因突變，考慮與西妥昔單抗誘導K-RAS基因發生突變導致繼發性耐藥有關。

有研究發現，PCR檢測接受西妥昔單抗治療腫瘤患者的外周血循環腫瘤細胞(CTCs)出現K-RAS突變通常較影像學提示腫瘤進展早10個月，因此可考慮作為早期檢測西妥昔單抗繼發性耐藥的重要手段[11]。MEK抑制劑可能逆轉K-RAS突變導致的西妥昔單抗繼發耐藥[12]。K-RAS突變是導致西妥昔單抗原發和繼發性耐藥的機制之一，隨著CTCs這一研究領域的不斷發展，檢測外周血循環腫瘤細胞可以盡早發現K-RAS基因突變狀態，盡早使用MEK抑制劑可能逆轉K-RAS突變導致的西妥昔單抗繼發耐藥。

通過檢索2011 - 2015年解放軍總醫院腫瘤內二科日間病房4年100余例晚期結直腸癌患者病例，其中10例由病理科進行原發灶及轉移病灶RAS基因檢測，目前僅此1例經治療后出現K-RAS基因突變，提示增加送檢率及再次穿刺轉移病灶進行基因檢測的必要性。

1 施敏，張俊，朱正綱．EGFR單抗治療晚期結直腸癌的療效預測標志物的研究進展［J］.世界華人消化雜志，2010，18（36）：3831-3837．

2 Soulières D， Greer W， Magliocco AM， et al. KRAS mutation testing in the treatment of metastatic colorectal cancer with anti-EGFR therapies［J］. Curr Oncol， 2010， 17（S1）：S31-S40.

3 Lièvre A， Bachet JB， Boige V， et al. KRAS mutations as an Independent prognostic factor in patients with advanced colorectal cancer treated with cetuximab［J］. J Clin Oncol， 2008， 26（3）：374-379.

4 Zachary I， Gliki G. Signaling transduction mechanisms mediating biological actions of the vascular endothelial growth factor family［J］.Cardiovasc Res， 2001， 49（3）： 568-581.

5 Haigis KM， Kendall KR， Wang Y， et al. Differential effects of oncogenic K-Ras and N-Ras on proliferation， differentiation and tumor progression in the colon［J］. Nat Genet， 2008， 40（5）：600-608.

6 Patra SK. Ras regulation of DNA-methylation and cancer［J］. Exp Cell Res， 2008， 314（6）： 1193-1201.

7 Esposito C， Rachiglio AM， La Porta ML， et al. The S492R EGFR ectodomain mutation is never detected in KRAS wild-type colorectal carcinoma before exposure to EGFR monoclonal antibodies［J］.Cancer Biol Ther， 2013， 14（12）： 1143-1146.

8 Misale S， Yaeger R， Hobor S， et al. Emergence of KRAS mutations and acquired resistance to anti-EGFR therapy in colorectal cancer［J］.Nature， 2012， 486（744）： 532-536.

9 Artale S， Sartore-Bianchi A， Veronese SM， et al. Mutations of KRAS and BRAF in primary and matched metastatic sites of colorectal cancer［J］. J Clin Oncol， 2008， 26（25）： 4217-4219.

10 Molinari F， Martin V， Saletti P， et al. Differing deregulation of EGFR and downstream proteins in primary colorectal cancer and related metastatic sites May be clinically relevant［J］. Br J Cancer， 2009，100（7）： 1087-1094.

11 Bouchahda M， Karaboué A， Saffroy R， et al. Acquired KRAS mutations during progression of colorectal cancer metastases：possible implications for therapy and prognosis［J］. Cancer Chemother Pharmacol， 2010， 66（3）： 605-609.

12 Troiani T， Napolitano S， Vitagliano D， et al. Primary and acquired resistance of colorectal cancer cells to anti-EGFR antibodies converge on MEK/ERK pathway activation and can be overcome by combined MEK/EGFR inhibition［J］. Clin Cancer Res， 2014， 20（14）：3775-3786.