HPLC法測定土霉素片中的土霉素含量

劉志會

[摘 要] 目的：建立高效液相法測定土霉素含量的方法。方法：采用Agilent-C18 （4.6mm×250mm，5μm）色譜柱；流動相：醋酸銨溶液-乙腈（85∶15）；檢測波長：280nm；流速：1.0ml/min；柱溫：30℃。結果：土霉素在0.12-9.6μg范圍內線性關系良好，r=0.9999，平均回收率為99.2%，RSD=0.6%（n=6）。結論：該方法簡便、準確、靈敏度高、重現性好，適用土霉素片的質量控制。

[關鍵詞] 高效液相色譜法；土霉素；含量測定

[中圖分類號]R927.2 [文獻標志碼] A [文章編號]1007-8517（2015）06-0010-02

土霉素是多環并四苯酸基酰胺母核的衍生物，為一種廣譜抗菌素，臨床上主要用于革蘭陽性菌、陰性菌感染，以及立克次體病、衣原體病、支原體病、螺旋體病的治療。目前土霉素片的含量測定方法為中國藥典規定的抗生素微生物檢定法，收載于衛生部藥品標準·抗生素分冊（第一冊）。該方法檢驗周期長、操作繁瑣、影響因素多、易造成誤差，且不能滿足批量生產質量控制的需要。筆者采用高效液相色譜法取代效價法測定土霉素片的含量，其檢驗周期短、結果準確、重現性好、穩定性好，現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UV-2401PC紫外分光光度計（日本島津）；LC-2010AHT高效液相色譜儀（日本島津）；梅特勒AG-135型電子天平；梅特勒TOLEDO型酸度計（精度：0.01pH單位）； KQ-5200E型超聲波清洗器。

1.2 材料 土霉素對照品（批號：130487-200302，含量：88.2%，中國藥品生物制品檢定所）；土霉素片（批號：140113、140118、140105，規格：0.25g）；所用試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：AgilentTM-C18（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱；流動相：醋酸銨溶液[0.25mol/L醋酸銨溶液-0.05mol/L乙二胺四醋酸二鈉溶液-三乙胺（100∶10∶1），用醋酸調節pH值至7.5]-乙腈（85∶15）；流速：1.0ml/min；柱溫：30℃；檢測波長：280nm；進樣量：10μl。理論塔板數按四環素峰計算應不低于3000，四環素峰與相鄰雜質峰的分離度應符合中國藥典2010年版二部附錄VD規定（不低于1.5）。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱定土霉素對照品30.31mg，置于50ml容量瓶中，用0.01mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取5ml，置于25ml容量瓶中，用0.01mol/L鹽酸溶液稀至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取土霉素片10片，精密稱定，平均片重0.3578g，研細，精密稱取0.3647g（約相當于土霉素0.25g），置于500ml容量瓶中，用0.01mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密吸取續濾液5ml，置于25ml容量瓶中，用0.01mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.3 色譜測定 分別精密量取對照品溶液（約0.1mg/ml）和供試品溶液（約0.1mg/ml）各10μl ，注入液相色譜儀測定，即得。見圖1、2。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 精密量取土霉素對照品溶液（0.1mg/ml）10μl，注入高效液相色譜儀，重復進樣6次，RSD為0.1%，說明精密度良好。

2.4.2 線性關系考察 取上述土霉素對照品溶液（0.1mg/ml），分別精取 1、3、5、10、20、40、60、80μl，注入液相色譜儀（自動進樣），記錄峰面積。以進樣量對峰面積進行回歸，得回歸方程：Y=213450X-89963，r=0.9999。

2.4.3 穩定性試驗 取同一批號樣品（批號：140118），分別于0、3、5、7、10、12、15、20、24、30h測定，結果RSD為0.3%，表明樣品在30h內穩定。

2.4.4 重現性試驗 取同一批號樣品（批號：140118），依供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，分別測定峰面積，計算土霉素含量。結果測得平均含量為95.7%，RSD為0.12%（n=6），表明該法重現性良好。

2.4.5 加樣回收試驗 精密稱取已知含量（670.34mg/g）的樣品6份，配置成所需濃度，和標準品溶液（0.53447mg/ml），各5ml，置于50ml量瓶中，加0.01mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續濾液各10μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算回收率。平均回收率99.2%，RSD=0.6%。結果見表1。

2.4.6 樣品的含量測定 取三批樣品，依法制備供試品溶液，精密吸取10μl，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，按外標法計算含量，結果批號為140113、140118、140105的土霉素樣品結果為95.6%、95.9%、95.5%。按微生物檢定法測定三批樣品結果為95.1%、95.2%、95.0%。

3 討論

在實驗中如果遇到土霉素主峰與相鄰雜質峰分離效果不能滿足實驗要求，可以減少乙腈的比例，改變流動相的極性，使土霉素主峰的保留時間延長，達到其與雜質峰分離的目的，具體改變多少，依據實驗條件反復摸索而定。

由試驗結果可知，該方法簡單、快捷、重現性好、靈敏度高，測定結果與微生物檢定法相吻合，并可批量檢測，可用于土霉素含量的質量控制。

參考文獻

[1] WS1-C2-0007-89，四環素片[S].中華人民共和國衛生部藥品標準.抗生素藥品（第一冊），1989.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010：635-636.