外泌體的生物學特性及臨床應用的研究進展

李 曉，劉玲英，柴家科

解放軍第一附屬醫院 全軍燒傷研究所，北京 100048

綜 述

外泌體的生物學特性及臨床應用的研究進展

李 曉，劉玲英，柴家科

解放軍第一附屬醫院 全軍燒傷研究所，北京 100048

外泌體是由細胞內涵體分泌的小囊泡，在細胞間信息傳遞中扮演重要角色。外泌體可通過受體介導的交互作用直接刺激靶細胞，或通過向靶細胞轉移各種生物活性分子如膜受體、蛋白質、mRNA和microRNA等方式發揮其生物學功能。隨著相關技術的完善，越來越多的研究將目光投向了利用外泌體進行疾病的診斷、預后及治療臨床應用。本文就其研究現狀和臨床應用做簡要綜述。

外泌體；細胞學；生理病理

近年來，細胞外小囊泡逐漸引起研究者的濃厚興趣，隨著2012年細胞外囊泡國際學會的成立，更加奠定了其重要地位。細胞分泌的膜性小囊泡有許多種，包括外泌體(exosomes)、脫落微泡(shedding microvesicle)、微球(microparticle)以及凋亡小體，它們雖成分不同，但均能介導細胞間的物質傳遞與信息交流[1]。提高對細胞外小囊泡的認識，不僅有助于進一步了解細胞的基本生理代謝和病理改變，而且對臨床疾病的診斷與治療也有重要的指導意義。外泌體是目前公認功能較強、研究較多的一類小囊泡。

1 外泌體簡介

1.1 外泌體生物特點 外泌體直徑40 ～ 100 nm，表面富含膽固醇、神經鞘磷脂、神經酰胺等脂類物質，其內載有蛋白質、mRNA、microRNA等生物信息，在細胞微環境中發揮重要作用[2]。1983年Johnstone等[3]首次發現羊成熟網織紅細胞可釋放一種膜性小囊泡，最初這種小囊泡被認為是用來排出多余的轉鐵蛋白受體，并將其稱為外泌體。1996年在B淋巴細胞中也發現了外泌體，且這些外泌體具有刺激T細胞增殖、抑制腫瘤生長等重要生物學活性[4]。隨后研究者發現除了體內活細胞，在體外培養的不同類型細胞中也能檢測到外泌體，如樹突狀細胞、上皮細胞、血小板、腫瘤細胞、間充質干細胞等[5]。接下來研究者又驚奇的發現，外泌體廣泛存在于任何體液中，包括唾液、血液、尿液、腦脊液，以及胸水、腹水等，這說明外泌體不僅是細胞正常生理病理代謝的產物，且分泌外泌體是一種普遍的細胞功能[6]。

1.2 外泌體的形成 為了區別外泌體與細胞代謝中產生的其他膜性小囊泡，研究者利用脈沖追蹤與電鏡鑒定發現，外泌體是經由內體途徑生成[7]。細胞內晚期內體的界膜多處凹陷，向內出芽形成管腔狀囊泡，從而轉變為具有動態亞細胞結構的多囊體(multi-vesicle bodys，MVBs)。MVBs是真核細胞重要的蛋白運輸與分揀中心，并與信號傳導、細胞質分裂、基因沉默、自噬、病毒出芽等過程密切相關。當MVBs與溶酶體融合后，其內的管腔狀囊泡發生降解；而與胞膜融合后，其內的管腔狀囊泡再次凹陷以內出芽方式形成顆粒狀小囊泡，并釋放入細胞外環境，即外泌體[8]。外泌體的生成是一個連續性的過程，某些類型的細胞如血小板經活化刺激后可增加外泌體的釋放，其他因素如自由基壓力、UV放射、膜膽固醇含量降低及胞內鈣離子水平升高等也能增加外泌體的含量[9-10]。

經過兩次內出芽，內體中各種物質被分選后載入外泌體。不同細胞來源外泌體表面攜帶有相似的保守蛋白，如CD9、CD63、CD81、Alix、Tsg101等，其內則分別含有與其來源細胞相關的特異性生物學物質[11]。這些物質不僅能反映其來源細胞類型(如成熟網織紅細胞來源外泌體含有大量轉鐵蛋白受體，而淋巴細胞或樹突狀細胞來源外泌體中則含量較少)，更重要的是還與其來源細胞的生理功能或病理改變密切相關(如腫瘤細胞來源外泌體既含有腫瘤抗原又含有腫瘤特異性microRNA)[12]。

1.3 外泌體內載物的分揀與運輸 在MVBs的形成過程中涉及了20多種囊泡分揀蛋白，其中最重要的是4種內體運輸分揀復合物(endosomal sorting complex required for transport，ESCRT)和液泡蛋白分選因子(vacuolar protein soaing 4，Vps4)。ESCRT是一種細胞膜塑形蛋白，能識別泛素化修飾的膜蛋白，介導內吞小泡出芽和MVBs形成，從而促進外泌體的產生[13-14]。其中，ESCRT0與包含素在內體膜上形成微域并富集泛素化的載體蛋白。ESCRTⅠ和Ⅱ型誘導MVBs出芽形成外泌體，并分揀蛋白加載入外泌體中。ESCRTⅢ型收縮及剪切芽頸幫助外泌體膜脫落。Vps4則可解離ESCRT以便其循環再利用。而泛素化及泛素化蛋白具有修飾或調控ESCRT的定位和功能的作用[15-16]。因此，ESCRT、Vps4及泛素化蛋白在內體上的銜接協同作用是促進MVBs形成、載體蛋白質分揀及外泌體生成的重要因素。當ESCRT亞結構或Vps4功能失活后，載體蛋白被不斷運輸進來與ESCRT一起蓄積在內體上，卻不能被正常分揀排出，從而導致內體膨脹變形，阻斷MVB形成途徑，最終無法產生外泌體。

由于內體是真核細胞中一種膜結合性的分隔體，為各種物質在被溶酶體降解前提供了一個可被分揀的環境，來自胞膜或高爾基體的物質到達內體后可與溶酶體結合發生降解，也可再循環至胞膜。因此在運輸過程中，內體中的蛋白能夠通過循環重新回到原處，或是通過聚集被后期分隔并包裹進外泌體。

2 外泌體的生物學功能

2.1 外泌體的作用途徑和方式 外泌體由來源細胞釋放入外環境后，距離較近的可由近分泌途徑直接被受體細胞吸收，距離稍遠的可由旁分泌途徑被吸收，還有部分外泌體循環入體內作用于全身系統由內分泌途徑被吸收。對于近距離的吸收，起初認為外泌體是與受體細胞非特異性結合發生胞膜融合后進入細胞。但近來發現這一過程與受體細胞表面特異性分子(如T細胞膜蛋白Tim4)的調節或受體細胞上4次跨膜蛋白有關，這說明外泌體的攝取并非完全隨機發生。外泌體被受體細胞吞噬后可到達吞解體，也可到達晚期內體的囊腔中，但外泌體是由吞解體裂解還是由晚期內體釋放于受體細胞質中，以及是什么原因導致了這種不同的吸收路線，目前還不清楚。組織特異性是否參與遠距離靶向吸收循環系統中的外泌體，仍是另一個潛在的研究方向。

目前認為，外泌體主要通過4種方式在細胞間發揮信息傳遞作用：1)外泌體作為信號復合物，通過細胞表面配體直接刺激受體細胞；2)外泌體在細胞間轉移受體；3)外泌體向受體細胞運送功能蛋白或傳染性顆粒；4)外泌體通過mRNA、microRNA或轉錄因子向受體細胞傳遞遺傳信息[17]。一旦外泌體被受體細胞吸收后，其內載有的脂質、蛋白質、mRNA、microRNA等成分可以通過改變轉錄和翻譯程序影響蛋白修飾和定位，調節信號級聯通路、關鍵酶反應以及細胞自動調節等方式影響受體細胞的細胞表型和功能，而來源細胞和受體細胞的種類及其生理病理狀態將決定具體是哪種機制發揮主要作用。

2.2 不同來源外泌體的不同作用 來源于不同細胞的外泌體在不同的生理、病理階段具有不同的功能。以動脈粥樣硬化、心肌梗死為例，在炎癥早期，中性粒細胞來源外泌體能刺激抗炎因子IL-10的產生，到了炎癥晚期。纖維母細胞來源外泌體則可能引起重組人單核細胞趨化蛋白-1 (monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)等促炎因子的升高[18]。更重要的是，在整個心肌缺血再灌注過程中，間充質干細胞來源外泌體能有效降低炎癥反應，減輕心肌損傷，并促進心肌修復[19]。科學家通過研究發現，血小板和巨噬細胞來源的外泌體聚集在動脈粥樣斑塊的脂質中心，能促發炎癥、血管新生以及血栓形成，這一發現對臨床診治具有指導意義，使外泌體成為一個潛在的治療靶點[20]。內皮功能障礙被認為是動脈粥樣硬化的起始事件，且與其他心血管疾病相關，受損內皮細胞釋放的外泌體則可作為一種生物標記物提示疾病嚴重程度[21]。

正常細胞來源外泌體能改變受損細胞表型及功能，同理病變細胞來源外泌體也能向正常細胞傳遞有害的生物信息。HIV感染的T細胞和EBV感染的B細胞來源外泌體載有病毒編碼物質，細菌感染的細胞來源外泌體含有病原菌，人腦瘤細胞來源外泌體攜有腦瘤基因受體EGFRvⅢ亦能轉移至正常細胞[22-24]。有趣的是，腫瘤細胞來源外泌體產量較高，盡管目前并不清楚是什么機制引起了或什么需求誘導了外泌體的升高，但這提示外泌體可能參與了腫瘤的發展。

3 外泌體作為生物標記物

外泌體不僅可以反映來源細胞的內容物，還可體現來源細胞的生理病理狀態，因而利用外泌體作為生物標記物不僅來源易得、檢測方便、變化較早、傷害較小，且由于外泌體膜與來源細胞的細胞膜具有同源性，故利用細胞膜上大量富集的蛋白進行免疫分選能提高診斷率。

由于尿液標本最易獲得，因此目前關于生物標記物的研究大多集中于尿液來源外泌體。有研究者發現，急性腎損傷模型尿液來源外泌體的胎球蛋白A含量較正常對照組增加50倍，且較傳統標記物尿中肌苷酸更早出現改變[25]。另有一些實驗已證實，尿液和腎小球濾過液來源外泌體能在前列腺癌和膀胱癌模型中發揮提示作用。體外培養的膀胱癌細胞來源外泌體包含大約350種蛋白，其中18種存在于膀胱癌患者尿液來源外泌體中，與正常人相比，有8種蛋白高表達，且這些蛋白大多與表皮生長因子信號通路有關。研究者接下來準備利用細胞培養基作為模型觀察外泌體對表皮生長因子信號通路的影響[26-27]。此外，還有研究者報道尿液來源外泌體中活化轉錄因子(activating transcription factor 3，ATF3)可能是急性腎小管損傷的新型生物標記物，腎母細胞瘤抑制基因(wilms tumor protein，WT-1)則可能反映慢性腎疾病相關足突狀細胞的損傷，但這些結果是否能最終應用于患者，仍需大樣本正規流程的臨床試驗予以驗證[28]。

盡管利用外泌體作為生物標記物具有諸多可喜的優勢，但仍有幾點需要注意：1)由于外泌體內載物含量較少，因此有效內容物的富集度決定了外泌體作為生物標記物的可行性。2)由于體液樣本自身存在蛋白和RNA，因此外泌體的分離和純化顯得尤為重要。3)體液中各種類型細胞來源外泌體也會成為混雜因素，如正常體內提取的血漿外泌體可能來源于紅細胞、淋巴細胞或血小板，而與血液循環直接或間接接觸的組織細胞包括血管內皮細胞或有窗孔的組織包括胎盤、肝也可能將外泌體釋放進入血液，因此對外泌體來源細胞的篩選也非常關鍵[29]。

4 外泌體作為藥物載體

理想的藥物載體需能逃避宿主免疫系統，被靶細胞特異性吸收，具有足夠時長的循環半衰期，無毒性，且能加載多種不同的藥物。因此外泌體作為一種天然的脂質體，被認為較目前廣泛使用的人工合成脂質體具有更多優勢[30]：1)外泌體內所含的大量蛋白質和遺傳信息說明外泌體可被加載大部分生物學物質；2)外泌體廣泛分布于人體各種體液，說明其在人體有良好的耐受性，因此外泌體載體的藥物在體內可保持一個較長的循環半衰期從而提高療效[31]；3)外泌體能穿過細胞膜將承載物質運送至靶細胞，如樹突狀細胞來源外泌體能將主要組織相容性復合體轉移到其他樹突狀細胞從而調節免疫[32]；4)外泌體自身特有定向歸巢能力，許多證據顯示外泌體的靶向性作用與其細胞來源有關，如黑色素瘤來源外泌體傾向于到達前哨淋巴結以促進腫瘤轉移[33]；5)外泌體能進行膜修飾從而增強細胞特異性靶向作用，例如加載了β分泌酶(beta-secretase 1，BACE1)siRNA的外泌體可穿過血腦屏障，將大腦神經元、小膠質細胞和少突細胞中BACE1的mRNA及蛋白表達下調60%左右[34]；6)與傳統人工合成脂質體不同的是，外泌體在體內、體外均能加載藥物；在體內通過轉染將藥物加載入來源細胞從而獲得目的外泌體；在體外通過電穿孔和脂質轉染法將目的藥物加載入純化后的外泌體中[35]。

5 結語

在各種生理和病理過程中，外泌體通過與受體細胞特異性結合并傳遞各種信息從而發揮了重要的生物學作用。進一步深入研究外泌體獨特的生物學結構和功能，不僅為各種疾病提供了一種安全便捷的早期診斷標記物，也為個體生物學治療提供了一種靶向性策略，還能為未來藥物載體的研發開啟一條全新的思路。

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Advances in biological characteristics and clinical application of exosomes

LI Xiao, LIU Lingying, CHAI Jiake
Department of Burn and Plastic, the First Affiliate Hospital of Chinese PLA General Hospital, Beijing 100048, China

CHAI Jiake. Email: cjk304@126.com

Exosomes are microvesicles derived from the endosomal compartment of cell. An increasing evidence indicates that exosomes play a pivotal role in intercellular information transmission, and they may directly stimulate target cells by receptormediated interactions or transfer various bioactive molecules including membrane receptors, proteins, mRNAs, and microRNAs to target cells. With the advances in technique, more studies are conducted to the clinical applications of exosomes for diagnosis, prognosis, and therapy. The increased understanding of exosomes reveals a very complex contribution of exosomes to health and disease. In this review, we summarize the current progress and clinical application of exosomes．

exosomes; cytology; physiopathology

R 363

A

2095-5227(2015)10-1042-04 DOI：10.3969/j.issn.2095-5227.2015.10.021

時間：2015-06-16 10:13

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150616.1013.001.html

2015-04-30

國家自然科學基金項目(81372052)；解放軍總醫院苗圃基金(14KMM22)

Supported by the National Natural Science Foundation of China(81372052)

李曉，女，博士，主治醫師，在站博士后。研究方向：干細胞治療。Email: yueer1985@126.com

柴家科，博士生導師，主任醫師，教授，所長。Email: cjk304@126.com