載體對外源蛋白表達(dá)的影響

王 寶 趙曉會 任瑩利 張文鈺 郝振華

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453000）

木聚糖（Xylan）是植物半維素的主要成份，它是復(fù)雜的低分子質(zhì)量的多糖，由β-D-木糖殘基通過β-1，4鍵連接成的主鏈和攜帶的各種取代基組成[1]。木聚糖是自然界中主要的可再生有機(jī)資源[2]，但長期以來得不到充分的重視和利用，造成極大的浪費(fèi)。現(xiàn)在，借助微生物代謝已成為降解利用木聚糖的重要工具，木聚糖酶已被應(yīng)用到造紙工業(yè)、食品加工、飼料、生物轉(zhuǎn)化等行業(yè)領(lǐng)域。實(shí)現(xiàn)木聚糖酶商業(yè)化的必要條件是獲得大量表達(dá)木聚糖酶的微生物菌株。重組DNA技術(shù)為蛋白質(zhì)產(chǎn)量的提高提供了技術(shù)手段，現(xiàn)已有上百種來自細(xì)菌和真菌等微生物的木聚糖酶基因被克隆出來并成功地在多種原核和真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。

已將β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶xynⅢ基因成功地連接到原核表達(dá)載體 pET20b（+）（分子量為 3716bp）和 pET21a（+）（分子量為 5443bp）上，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）。 為了確定 xynⅢ基因在哪個載體中更能高效表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)對其作了研究比較。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）菌株與載體 大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）為實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。 pET20b（+）和 pET21a（+）為 Novagen公司產(chǎn)品。

（2）主要試劑 胰蛋白胨（Tryptone），酵母抽提物（Yeast Extract），瓊脂糖（Agarose）,牛血清蛋白，樺木木聚糖等生化試劑均為TaKaRa產(chǎn)品；氨芐青霉素Amp購自創(chuàng)生公司，DNA分子量Marker（DL2000、λHindⅢ）購自TaKaRa公司，蛋白質(zhì)分子量Marker購自寶賽公司，氫氧化鈉、氯化鈉等普通試劑為分析純。

（3）主要儀器SK18型高速冷凍離心機(jī)，SectrophotometerND-1000，JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，衡溫振蕩培養(yǎng)箱，紫外透射儀紫外分光光度計(jì)。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒的提取

（1）挑取含有重組質(zhì)粒 pET21a（+）-xynⅢ和 pET20b（+）-xynⅢ的單克隆，分別接種于10 ml含有100mg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，220 rpm，搖床過夜培養(yǎng)。

（2）用紫外分光光度儀檢測菌體濃度顯示均為2.2，剩余菌液用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，并用Sectrophotometer ND-1000測其濃度。

1.2.2 PCR擴(kuò)增xynⅢ，并通過電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的亮度

分別以重組質(zhì)粒 pET21a（+）-xynⅢ和 pET20b（+）-xynⅢ為模板對xynⅢ進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR體系如下∶

表1 xynⅢ的PCR體系加樣量

PCR 程序∶94℃ 3min；94℃ 30s，52.8℃ 30s，72℃ 40s，15 個 循 環(huán) ；72℃ 7min。

1.2.3 SDS-PAGE電泳檢測外源蛋白表達(dá)

（1）挑取含有重組質(zhì)粒和含有空質(zhì)粒 pET21a（+）/pET20b（+）的單克隆，分別接種于3 ml含有50mg/mLAmp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，220 rpm，搖床過夜培養(yǎng)。

（2）取上述過夜培養(yǎng)物以1/100的比例轉(zhuǎn)接入含50 mg/mL Amp的 LB液體培養(yǎng)基中，37℃，220rpm，培養(yǎng) 2-3h（OD 值達(dá)到 0.6-0.8），加入IPTG于30℃條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h。

（3）分別取IPGT誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后的菌液樣品l ml，收集菌體，用30 uL的PBS緩沖液 （pH7.2）重懸細(xì)胞沉淀，再加入6×SDS-PAGE buffer，混勻后100℃煮沸10 min，離心取上清，即可用于SDS-PAGE檢測。

1.2.4 蛋白含量測定

采用Bradford法測定蛋白濃度[3]，以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

蛋白濃度 C=（91.69Y+2.743）/V

其中:C——蛋白濃度，單位 μg/μl；

Y——A595值；

V——加樣體積，單位μl。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒濃度的測定結(jié)果

用Sectrophotometer ND-1000對提取的質(zhì)粒測濃度。結(jié)果如表2。

表2 質(zhì)粒濃度檢測結(jié)果

由此可以看出∶在菌體濃度相同的情況下，分子量小的質(zhì)粒對菌體細(xì)胞造成的負(fù)荷較小，從而在細(xì)胞中的擴(kuò)增倍數(shù)較多。

2.2 PCR擴(kuò)增xynⅢ的電泳檢測結(jié)果

分別以質(zhì)粒 pET21a（+）-xynⅢ和 pET20b （+）-xynⅢ為模板對xynⅢ進(jìn)行PCR，通過電泳檢測（如圖1）可以明顯看出以 pET20b （+）-xynⅢ為模板擴(kuò)增的基因產(chǎn)量高。足以說明在相同體積下 pET20b（+）-xynⅢ質(zhì)粒濃度大。

2.3 pET21a （+）-xynⅢ 和pET20b（+）-xynⅢ表達(dá)產(chǎn)物檢測結(jié)果

以大腸桿菌的超聲波破碎酶液為對照∶將全細(xì)胞蛋白和超聲波破碎細(xì)胞離心后得到的上清酶液進(jìn)行SDSPAGE檢測，如圖2所示，有明顯的外源蛋白產(chǎn)物條帶出現(xiàn)；pET20b（+）-xynⅢ表達(dá)產(chǎn)物的條帶明顯比pET21a（+）-xynⅢ表達(dá)產(chǎn)物的條帶亮。

2.4 蛋白含量的測定

在595nm下，用紫外分光光度儀測兩種重組菌的酶液上清的吸光值，得到表3的數(shù)據(jù)，進(jìn)而帶入公式計(jì)算出各蛋白的濃度。明顯看出pET20b（+）-xynⅢ表達(dá)產(chǎn)物的量多于 pET21a（+）-xynⅢ表達(dá)產(chǎn)物的量。

表3 595nm下的吸光值及蛋白濃度

3 討論

外源基因表達(dá)產(chǎn)量與細(xì)胞濃度和細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)量呈正相關(guān)。單個細(xì)胞產(chǎn)量取決于∶外源基因的拷貝數(shù)。本實(shí)驗(yàn)所選用的pET20b（+）載體因?yàn)槠浞肿恿啃∮趐ET21a（+）載體的分子量，在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增時對細(xì)胞造成的負(fù)荷會小一點(diǎn)，所以pET20b（+）載體的拷貝數(shù)多于pET21a（+）載體的，進(jìn)而載體上所連接的外源基因的拷貝數(shù)也多，因此外源基因的表達(dá)產(chǎn)量會相對的增多。

［1］張世敏，劉寅，劉新育，等.木聚糖酶基因研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)雜志，2006，7，26（4）:61-67

［2］何成新，張厚瑞.木聚糖水解酶的研究進(jìn)展[J].廣西輕工業(yè)，1998，4:12-15.

［3］Bradford M.A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Proein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding[J].Anal Biochem，1976，72∶248-254.