熱化聯(lián)合對肺癌患者A549細(xì)胞生長、c-Jun N-末端激酶磷酸化及熱休克蛋白70表達(dá)的影響

吳海喬，田 甜，胡君程，林 蓁

(中國人民解放軍第174醫(yī)院病理科，福建 廈門 361000)

熱化聯(lián)合對肺癌患者A549細(xì)胞生長、c-Jun N-末端激酶磷酸化及熱休克蛋白70表達(dá)的影響

吳海喬，田 甜，胡君程，林 蓁

(中國人民解放軍第174醫(yī)院病理科，福建 廈門 361000)

目的 觀察熱化聯(lián)合對肺癌患者A549細(xì)胞生長的影響及機制探討。方法對A549細(xì)胞分別進(jìn)行單獨熱療、單獨化療，熱化聯(lián)合干預(yù)及熱化聯(lián)合并SP600125干預(yù)，同時選取未做任何處理的A549細(xì)胞作為對照組。觀察各組細(xì)胞增殖率、細(xì)胞侵襲力的變化。同時采用蛋白免疫印記法(Western Bolt）檢測JNK磷酸化以及熱休克蛋白70(HSP70)的表達(dá)。結(jié)果熱化聯(lián)合組的A549細(xì)胞增值率明顯低于單獨熱療、單獨化療和熱化聯(lián)合并SP600125組(P＜0.05)。熱化聯(lián)合組JNK磷酸化表達(dá)明顯高于對照組及單獨化療組(P＜0.05)，熱化聯(lián)合組HSP70表達(dá)明顯低于單獨熱療組(P＜0.05)。熱化聯(lián)合干預(yù)下，p-JNK表達(dá)水平出現(xiàn)上升，與對照組、單獨熱療組和單獨化療組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；熱化聯(lián)合并SP600125組的p-JNK的表達(dá)水平較熱化聯(lián)合組顯著下降(P＜0.05)。結(jié)論熱化聯(lián)合抑制A549細(xì)胞增殖的效果優(yōu)于單獨熱療或單獨化療，作用機制可能與激活JNK信號通路或抑制HSP70表達(dá)有關(guān)。

熱化；A549細(xì)胞；c-Jun N-末端激酶磷酸化；熱休克蛋白70

目前，肺癌在全世界的發(fā)病率均呈現(xiàn)逐年上升的趨勢[1]。在我國，肺癌已經(jīng)成為危及群眾健康與生命的最大殺手。以往對于肺癌患者的治療多以化療為主[2]。熱療是近年來興起的一種新型治療方式，在一些腫瘤患者的臨床應(yīng)用中，已取得了一定的成績[3-4]。特別是熱療聯(lián)合化療往往起到意想不到的療效。但目前關(guān)于熱化聯(lián)合治療腫瘤的機制尚不清楚，因此，本研究就A549細(xì)胞的增殖以及C-Jun N-末端激酶信號通路、熱休克蛋白70(HSP70)的表達(dá)水平等情況進(jìn)行實驗觀察，試圖闡述腫瘤熱化療的臨床作用機制。

1 材料與方法

1.1 一般材料 本實驗所用的人肺癌A549細(xì)胞購于上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，化療藥物為紫杉醇(四川太極制藥有限公司；H19994040)。噻唑藍(lán)(Sigma公司)，小鼠抗人HSP70單克隆抗體(美國Santa Cruz生物技術(shù)公司)，兔抗人JNK抗體和p-JNK(Thr183PTyr185)抗體(美國SantaCruz生物技術(shù)公司)。

1.2 研究分組 本研究設(shè)立單獨熱療組、單獨化療組、熱化療聯(lián)合組、熱化聯(lián)并SP600125組以及對照組。藥物使用及劑量如下：①單獨熱療組(43℃，0 μg/L紫杉醇)；②單獨化療組(37℃，50 μg/L紫杉醇)；③熱療聯(lián)合組(43℃，50 μg/L紫杉醇)；④熱化聯(lián)并SP600125組(43℃，50 μg/L紫杉醇，50 μmol/L SP600125)；⑤對照組(37℃，0 μg/L紫杉醇)。

1.3 A549細(xì)胞生長檢測 采用噻唑藍(lán)比色法(MTT)進(jìn)行檢測。首先，將指數(shù)生長期的A549細(xì)胞配置成2.5×107個PL細(xì)胞懸液，然后將懸液注入96孔的培養(yǎng)板中，每個孔中加入200 LlP，每個組均設(shè)立6個復(fù)孔。24 h后，將培養(yǎng)板內(nèi)的懸液倒掉，然后注入不同濃度的紫杉醇培養(yǎng)液，每個孔內(nèi)200 μl。注入完畢后，采用水浴法將培養(yǎng)板加熱，溫度設(shè)定為43℃，時間設(shè)置為40 min，同時設(shè)立37℃水浴作為對照組。水浴時間到后，將培養(yǎng)板放置于5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)，溫度設(shè)定為37℃。培養(yǎng)24 h后，取出培養(yǎng)板，在每個孔中加入MTT 20 μl，濃度為5 g/L。常溫條件下進(jìn)行培養(yǎng)4 h，時間到后，倒掉培養(yǎng)液，在每個孔中加入150 μl DMSO，同時使用振蕩器進(jìn)行震蕩處理，時間為10 min。利用酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞生長增殖率。

1.4 蛋白免疫印記法(Western Bolt)檢測 收集細(xì)胞提取液，分別于電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育后進(jìn)行蛋白檢測。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS14.0軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，均數(shù)比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組A549細(xì)胞增殖率比較 研究發(fā)現(xiàn)，單獨熱療組、單獨化療組以及熱化療聯(lián)合組細(xì)胞增殖率均明顯低于對照組(χ2單獨熱療=6.684，χ2單獨化療=4.530，χ2熱化療聯(lián)合=9.238，P＜0.05)。熱化聯(lián)合并加入SP600125組細(xì)胞增殖率與對照組比較，差異無明顯的統(tǒng)計學(xué)意義(χ2聯(lián)合+SP600125=2.741，P＞0.05)。熱化療聯(lián)合組細(xì)胞增殖率明顯低于單獨熱療組以及單獨化療組(χ2單獨熱療= 3.474，χ2單獨化療=3.276，P＜0.05)，見表1。

表1 各組A549細(xì)胞增殖率比較(±s)

表1 各組A549細(xì)胞增殖率比較(±s)

注：與對照組比較，aP＜0.05；與單獨熱療組比較，bP＜0.05；與單獨化療組比較，cP＜0.05。

對照組單獨熱療組單獨化療組熱化療聯(lián)合組熱化聯(lián)合并加入SP600125組56.46±8.56 27.92±6.01a31.59±10.37a14.90±6.94abc45.34±5.05 6 6 6 6 6 3 3 3 3 3

2.2 各組HSP70表達(dá)水平比較 實驗檢測顯示，單獨熱療組以及熱化聯(lián)合組HSP70表達(dá)明顯高于對照組(P＜0.05)，熱化聯(lián)合組HSP70表達(dá)明顯低于單獨熱療組(P＜0.05)，見表2。

表2 各組HSP70表達(dá)水平比較(±s)

表2 各組HSP70表達(dá)水平比較(±s)

注：與對照組比較，aP＜0.05；與單獨熱療組比較，bP＜0.05。

組別 重復(fù)次數(shù)HSP70水平對照組單純熱療組單純化療組熱化聯(lián)合組3 3 3 3 3.66±1.46 8.84±2.37a1.29±0.82 6.53±2.42ab

2.3 各組JNK磷酸化水平比較 實驗檢測提示，除對照組外，其他各組JNK水平表達(dá)之間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；而在熱化聯(lián)合干預(yù)下，p-JNK表達(dá)水平出現(xiàn)上升，與對照組、單獨熱療組和單獨化療組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；熱化聯(lián)合并SP600125組的p-JNK的表達(dá)水平較熱化聯(lián)合組顯著下降(P＜0.05)。

表3 各組JNK磷酸化水平比較(±s)

表3 各組JNK磷酸化水平比較(±s)

注：與對照組比較，aP＜0.05；與熱化聯(lián)合組比較，bP＜0.05。

組別JNK磷酸化水平重復(fù)次數(shù)對照組單純熱療組單純化療組熱化聯(lián)合組熱化聯(lián)合并SP600125組80.25±5.42b91.89±2.31ab92.21±1.55ab118.99±2.47ab90.12±2.25a 3 3 3 3 3

3 討論

目前，臨床上用于治療腫瘤的方式方法眾多，比較常見的有手術(shù)、藥物化療、放射療法以及生物療法等[5-6]。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，熱療已廣泛應(yīng)用于臨床各類腫瘤的治療當(dāng)中，取得了較好的臨床療效，并認(rèn)為是屬于上述4種療法之后的第5種腫瘤治療方法[7]。本研究通過肺癌A549細(xì)胞，觀察了熱療聯(lián)合對細(xì)胞的增殖率抑制的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，熱療聯(lián)合干預(yù)A549細(xì)胞，能夠明顯治愈腫瘤細(xì)胞的生長。而且細(xì)胞增殖的抑制率明顯高于單獨化療組。該結(jié)果表明，43℃條件下，化療藥物紫杉醇的敏感性會增強。此前，有研究表明[8]，紫杉醇在43℃緩解下可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中ROS水平的上升，加快腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而達(dá)到臨床治療腫瘤的作用。還有一些研究表明[9-11]，臨床上對于一些腫瘤的治療，可以適當(dāng)進(jìn)行微波加熱，可以起到增強化療藥物敏感性的效果。

JNK屬于絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)中重要的組成成員，其構(gòu)成中的Thr183以及Tyr185兩個位點在正常情況下處于休眠狀態(tài)，當(dāng)出現(xiàn)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，Thr183以及Tyr185可以形成p-Thr183、p-Tyr185。目前的研究認(rèn)為，p-JNK可以明顯抑制細(xì)胞的生長以及增殖，同時促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡[12-13]。本研究顯示，JNK信號通路在加熱后能夠被激活。研究結(jié)果顯示，熱化聯(lián)合干預(yù)A549細(xì)胞后，雖然總JNK未見明顯的表達(dá)，但其p-JNK蛋白出現(xiàn)了現(xiàn)在的上升，而且上升程度顯著高于單獨熱療以及單獨化療組。此外，研究結(jié)果顯示，熱化療加入SP600125后，A549細(xì)胞的增殖率明顯高于對照組，提示SP600125能夠較大程度上對JNK抑制A549細(xì)胞生長的發(fā)生起到作用，提示熱療聯(lián)合對A549細(xì)胞的生長抑制作用可能是通過JNK信號通路而產(chǎn)生的。

HSP70蛋白家族屬于HSPs中最為保守以及最為主要的一類蛋白[14]，目前的實驗研究表明[15]，HSP70擁有分子伴侶樣的作用。實驗研究證明，HSP70可以通過抑制多種凋亡通路來起到抑制細(xì)胞凋亡的效果。因此，HSP70對于細(xì)胞的生長以及增殖起到顯著的保護(hù)作用。本研究顯示，HSP70在單獨熱療組的表達(dá)要明顯高于熱化聯(lián)合組，這提示熱化聯(lián)合干預(yù)后的協(xié)同效果對抗了HSP70對腫瘤細(xì)胞的保護(hù)作用，比單獨熱療更能抑制腫瘤細(xì)胞的生長。但是，本研究進(jìn)行的實驗尚處于初步，還不能說明此種協(xié)同作用是通過哪種途徑來發(fā)揮作用，這還有待于進(jìn)一步研究的深入來揭示。

綜上所述，熱化聯(lián)合抑制A549細(xì)胞增殖的效果優(yōu)于單獨熱療或單獨化療，作用機制可能與激活JNK信號通路或抑制HSP70表達(dá)有關(guān)。

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Influence of thermalization on A549 cells growth,c-Jun N-terminal kinase phosphorylation and expression of heat shock protein 70 in patients with lung cancer.

WU Hai-qiao,TIAN Tian,HU Jun-cheng,LIN Zhen.Department of Pathology,the 174thHospital of Chinese People's Liberation Army,Xiamen 361000,Fujian,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of thermalization on A549 cells growth in patients with lung cancer and its mechanism.MethodsA549 cells were given thermotherapy alone(group A),chemotherapy alone (group B),and thermotherapy combined with chemotherapy(group C),thermotherapy combined with chemotherapy and SP600125 intervention(group D).Untreated A549 cells were selected as the control group.The changes of cell invasion,proliferation rate of the cells in each group were observed.Phosphorylated JNK and expression of heat shock protein 70(HSP70)were detected by Western blot.ResultsA549 cell proliferation rate of group C was significantly lower than that of group A,group B and group D(P＜0.05).The expression of group C was significantly higher than that of control group and group B(P＜0.05),and the expression of HSP70 in group C was significantly lower than that in group A(P＜0.05).In group C,the expression level of p-JNK increased,compared with the control group,group A and group B,with statistically significant difference(P＜0.05).In group D,the expression level of p-JNK decreased significantly compared with group C(P＜0.05).ConclusionThermotherapy combined with chemotherapy had better effects in inhibiting proliferation of A549 cells than thermotherapy or chemotherapy alone.The mechanism may be related to the activation of JNK signal pathway or inhibiting expression of HSP70.

Thermotherapy;A549 cell;c-Jun N-terminal kinase phosphorylation;Heat shock protein 70

R734.2

A

1003—6350（2013）03—0326—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.03.0118

2014-06-10)

吳海喬。E-mail：1589725541@qq.com