IL-18、TNF-α、CRP在甘油致大鼠急性腎損傷中的變化及意義

楊浩強，黃向陽，孟曉燕，張 敏，譚鶴長

(柳州市工人醫院腎內科，廣西 柳州 545005)

IL-18、TNF-α、CRP在甘油致大鼠急性腎損傷中的變化及意義

楊浩強，黃向陽，孟曉燕，張 敏，譚鶴長

(柳州市工人醫院腎內科，廣西 柳州 545005)

目的 通過檢測白細胞介素-18(IL-18)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、C反應蛋白(CRP)在甘油致大鼠急性腎損傷中各個時間點的變化，探討炎癥反應是否參與了大鼠甘油急性腎損傷發病過程。方法40只大鼠被隨機分為實驗組(GL組，n=32)和對照組(NS組，n=8)，其中GL組按注藥后各個時間點不同將GL組依次分為GL 24 h組、GL 48 h組、GL 72 h組、GL 96 h組，各小組8只，分別檢測注藥后各個時間點大鼠血肌酐(Scr)、IL-18、TNF-α、CRP等相關生化指標，并進行統計學相關分析，同時觀察各個時間點大鼠腎臟病理變化。結果實驗組各個時間點Scr、IL-18、TNF-α、CRP等生化指標均較對照組明顯升高，差異均具有統計學意義(P＜0.05)；腎臟病理提示腎小管較對照組明顯變性。結論在甘油致大鼠急性腎損傷中，炎癥因子IL-18、TNF-α、CRP明顯升高，提示炎癥反應參與了大鼠甘油急性腎損傷發病過程，且腎小管為大鼠甘油急性腎損傷主要靶位。

甘油；急性腎損傷；炎癥因子

急性腎損傷(AKI)是高發病率和高死亡率疾病，其發病機制目前尚未完全清楚，而且不同方法、不同動物建立的AKI傷模型各有特點，因此建立動物模型對全面深入地研究AKI發病機制和尋找高效的治療途徑以及特效藥物有著十分重要的意義。目前有研究表明炎癥反應參與AKI發病過程，而在甘油急性腎損傷中尚未見有相關報道。本研究通過甘油肌肉注射法創建大鼠AKI動物模型，探討炎癥反應是否參與大鼠甘油急性腎損傷發病過程，從而為臨床提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象 購自廣西醫科大學試驗動物中心健康成年雄性SD大鼠40只，體重200～220 g，SPF級。

1.2 飼養條件 大鼠飼養于動物試驗中心，動物中心溫度設置在20℃～28℃，空氣濕度控制在50%～60%，采用明亮、黑暗各12 h交替的照明措施，大鼠分籠喂養，24 h內自由飲水進食。

1.3 試驗主要藥品、試劑 50%甘油溶液(武漢大華偉業醫藥化工有限公司)，大鼠IL-18 ELISA試劑盒(上海科華生物工程有限公司)，大鼠TNF-αELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.4 大鼠甘油急性腎損傷采用的診斷標準 診斷標準采用AKIN共識標準中的48 h內Scr較基線升高＞50%[1]，排除梗阻性腎病或脫水狀態。

1.5 操作方法

1.5.1 分組方法 40只大鼠被隨機分為實驗組(GL組，n=32)和對照組(NS組，n=8)，其中GL組按注藥后時間不同依次分為GL 24 h組、GL 48 h組、GL 72 h組、GL 96 h組，每組各8只；SD大鼠適應性喂養3 d后，按隨機數字法平均分為5組，隨機分配到GL組和NS組中。

1.5.2 實驗步驟 GL組大鼠采用50%甘油鹽水10 mg/kg單次雙后肢肌肉注射創建大鼠AKI模型，NS組采用10 ml/kg生理鹽水單次雙后肢肌肉注射，然后取各時間點大鼠，吸入乙醚麻醉后腹正中切開，門靜脈采血行Scr、IL-18、TNF-α、CRP測定，摘除雙腎行HE病理切片。

1.5.3 檢測方法 IL-18、TNF-α采用ELISA法，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書操作，用酶標儀在450 nm測定吸光值，計算其回歸方程，最終推算其相應的濃度；Scr、CRP采用全自動生化檢測儀測定；腎臟經過甲醛固定、梯度乙醇脫水、包埋、切片、二甲苯固定、染色等層序制作大鼠腎臟HE病理切片。

1.6 觀察指標：(1)大鼠一般情況；(2)血生化指標變化：Scr、IL-18、TNF-α、CRP等生化指標變化；(3)腎臟病理變化。

1.7 統計學方法 所有計量資料采用均數±標準差(x-±s)表示，應用SPSS17.0統計軟件進行分析；成組設計的多樣本比較采用區組設計方差分析，組內多個均數間兩兩比較采用LSD檢驗，設檢驗水準為α=0.05，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般情況 注藥后兩組大鼠體重無明顯變化，均無死亡，但GL組大鼠出現精神萎靡、毛色稀疏發黃無光澤、閉眼懶動、進食尿量減少等現象，且上述現象隨時間加重。

2.2 血生化指標變化 各組大鼠Scr、IL-18、TNF-α、CRP測定結果見表1。與NS組比較，GL組Scr 24 h時未見明顯升高(P＞0.05)，48 h時明顯高于NS組，差異有統計學意義(P＜0.05)，72 h明顯較基線升高＞50%，24～96 h內呈持續性升高趨勢；與NS組比較，GL組IL-18在24 h時升高不明顯(P＞0.05)，48 h時明顯上升，差異有統計學意義(P＜0.05)，之后開始下降，至96 h時仍處于較高水平；與NS組比較，GL組TNF-α在24 h時明顯升高，明顯高于NS組，差異有統計學意義(P＜0.05)，48 h時達到峰值，至96 h時仍有較高水平；與NS組比較，GL組CRP在24 h時明顯升高，差異有統計學意義(P＜0.05)，72 h時達到峰值，至96 h時仍有較高水平。

表1 各組大鼠Scr、IL-18、TNF-α、CRP測定結果(n=8，±s)

表1 各組大鼠Scr、IL-18、TNF-α、CRP測定結果(n=8，±s)

注：GL組與NS比較，aP＜0.05，GL組內各組間比較，bP＜0.05。

組別Scr(μmol/L)IL-18(ng/L)TNF-α(pg/ml)CRP(ng/ml)NS組GL 24 h組GL 48 h組GL 72 h組GL 96 h組F值P值46.8±5.4 47.3±5.2 58.9±7.1ab87.4±11.3ab108.6±12.5ab48.3 0.00 18.5±4.4 19.3±4.5 42.6±9.5ab40.4±9.1a36.3±8.7a27.4 0.00 35.7±5.4 61.8±8.3ab 158.9±21.3ab135.8±13.8ab121.6±12.3ab19.3 0.00 3.4±0.8 4.4±1.1ab6.6±1.4ab9.7±1.8ab8.3±1.6ab45.6 0.00

2.3 腎臟病理變化 同NS組比較，除GL組腎小球有淤積的紅細胞外，兩組腎小球未見明顯異常，但GL組腎小管明顯變性，可見腎小管上皮細胞刷狀緣脫落、胞質空泡變性、管腔擴張、腎小管管型、炎癥細胞浸潤，且腎小管變性隨時間加重(見圖1)。

圖1 各個時間點大鼠腎臟HE病理HE染色結果

3 討論

隨著近年來醫藥工業的迅猛發展，新藥不斷在臨床上應用，藥物誘導AKI呈逐年增長的趨勢，已成為臨床醫藥工業不可回避的問題。依據AKI診斷標準已有報道稱藥物導致AKI發病率占AKI總發病率的8%～60%，而在危重病患者，AKI死亡率高達60.3%[2-3]，表明AKI是高發病率和高死亡率疾病。目前AKI發病機制尚未完全清楚，在藥物導致AKI總發病機制中已有藥物直接毒性作用、氧化應激、細胞凋亡壞死、一氧化氮等機制，但隨著近年來基礎研究進一步深入，炎癥反應在AKI作用機制逐漸受到人們的重視。炎癥反應是炎癥物質引起的血管內發炎，輕微的炎癥反應無全身或局部的臨床感染征象，但是存在低水平、持續的炎癥狀態，表現為炎癥因子升高，目前在甘油導致AKI中尚未有炎癥反應相關報道。

甘油為滲透壓高達7 692 mOsm的高滲性物質，甘油肌注后即可引起局部肌肉變性壞死以及局部紅細胞溶解，由于肌紅蛋白和血紅蛋白分子量較小，能自由通過腎小球而進入腎小管，而腎小管不能吸收而形成管型堵塞腎小管，引起腎小管和間質損傷；此外，肌紅蛋白和血紅蛋白都可分解為高鐵血紅素，對腎小管直接產生毒性作用；因此甘油AKI模型與臨床嚴重組織創傷所致AKI極為相似，對擠壓型AKI研究有著重要意義，因此建立動物模型對全面深入地研究急性腎損傷發病機制和尋找高效的治療途徑以及特效藥物有著十分重要的意義。本研究Scr變化表明，在24～72 h內Scr較基線升高＞50%，且無大鼠死亡，表明10 mg/kg 50%甘油雙后肢肌肉注射創建大鼠甘油AKI模型成立。

在AKI中腎小管上皮細胞損傷會引發損傷關聯分子模式的釋放，此物質可激活Toll樣受體[4]，Toll樣受體激活轉錄因子-κB(NF-κB)，產生大量的趨化因子和細胞因子，這些趨化因子及細胞因子上調粘附分子和吸引炎癥細胞，如中性粒細胞和T細胞，造成腎臟本區域的損傷；另一方面目前研究較多的氧化損傷介導的氧化應激損傷可加重炎癥反應，研究表明氧自由基介導的細胞毒性和脂質過氧化損傷可以通過放大炎癥反應、變態反應和直接毒性作用導致全身或局部組織損傷[5-6]。

IL-18是主要由單核巨噬細胞及腎小管上皮細胞、腎小球系膜細胞、腎小囊臟層上皮細胞等腎實質細胞產生的促炎癥細胞因子，屬于IL-1家族成員，在AKI中可誘導近端腎小管表達，并裂解釋放進入尿液中，IL-18可以誘導T細胞產生IFN-γ，還可以促進其他細胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-8及一氧化氮等的生成[7]。本研究結果表明，在GL實驗組中，IL-18在48 h明顯升高且明顯高于NS對照組，提示在甘油致大鼠急性腎損傷中IL-18表達上調；與兒童心臟術后AKI研究結果IL-18在術后6 h時明顯升高，并于術后12 h左右達到高峰，2 d后仍較基線明顯升高的已發表研究相符合[8-9]。

TNF-α是一種具有多種生物功能的多肽，在許多傳染病和炎癥性疾病中起著核心作用，TNF-α在腎臟疾病損害中的作用機制包括促進內皮細胞的損傷、加重腎臟缺血、促進腎小球內微血栓的形成等；TNF-α在AKI中產生是高度依賴于活性氧、NF-κB活化和活化p38蛋白。本研究結果表明，在GL組中24 h明顯較NS組升高(P＜0.05)，48 h達到峰值，至96 h仍有較高水平，提示在甘油急性腎損傷中TNF-α明顯升高。本實驗研究結果與Ramesh研究順鉑致腎損傷中TNF-α介導趨化因子、細胞因子表達及Kuhad等研究姜黃素對順鉑腎毒性的炎癥和氧化應實驗效果中血清TNF-α水平的變化結果相符合[10-11]。

CRP是由肝臟在各種刺激下合成并分泌的一種非特異性急性時相中間產物，是人體非特異性免疫的一部分，CRP在正常情況下呈低表達狀態，但在組織損傷、壞死時明顯分泌增多。本研究結果表明，GL組CRP在24 h明顯升高，72 h達到峰值，至96 h仍有較高水平，表明在甘油致大鼠急性腎損傷過程中CRP有異常升高。

大量的臨床研究及基礎研究表明：甘油急性腎損傷腎臟病變主要為腎小管上皮細胞功能障礙。本實驗腎臟病理HE染色結果提示：GL組與NS組比較，除GL組腎小球有紅細胞淤積外，兩組腎小球未見明顯異常；NS組腎小管未見明顯異常，但GL組大鼠腎小管明顯變性，且腎小管病變隨時間而逐漸加重，即本研究結果證實了甘油腎毒性作用靶點主要針對腎小管而不是腎小球。本研究結果與廖長秀等[12]在阿魏酸鈉對甘油致小鼠腎臟氧化性損傷的拮抗效應中研究結果(甘油急性腎損傷時腎臟病變主要在腎小管)是相符合的。

綜上所述，在甘油致大鼠急性腎損傷中，炎癥因子IL-18、TNF-α、CRP明顯升高，表明炎癥狀態參與了大鼠甘油急性腎損傷發病過程；同時腎臟病理表明腎小管為大鼠甘油急性腎損傷主要靶位。

[1]Mehta RL,Kellum JA,Shah SV,et a1.Acute kidney injury network: report of an initiative to improve outcomes in acute kidney injury [J].Crit Care,2007,11(2):R31.

[2]Bellomo R,Kellum JA,Ronco C.Acute kidney injury[J].Lancet, 2012,380(9843):756-766.

[3]Bengatta S,Armould C,Letavernier E,et al.MMP9 and SCF protect from apoptosis in acute kidney injury[J].J Am Soc Nephrol, 2009,20(4):87-89.

[4]Miller RP,Tadagavadi RK,Ramesh G,et al.Mechanisms of Cisplatin nephrotoxicity[J].Toxins(Basel),2010,2(11):2490-2518.

[5]李 冰,潘志銑,劉素雁,等.甘油致BALB/C小鼠急性腎損傷后腎臟觀察[J].國際免疫學雜志,2011,34(4):318-322.

[6]夏曉紅,申玉學,石紀才,等.拮抗內皮素生物學效應對甘油所致大鼠急性腎功能衰竭的影響[J].中國病理生理雜志,2009,15(4): 123-128.

[7]張 璇,張玉萍.IL-18的研究進展[J].實用癌癥雜志,2012,27 (5):533-555.

[8]Parikh CR,Mishra J,Thiessen-Philbrook H,et al.Urinary IL-18 is an early predictive biomarker of acute kidney injury after cardiac surgery[J].Kidney Int,2006,70(1):199-203.

[9]Parikh CR,Mishra J,Thiessen-Philbrook H,et al.Urinary IL-18 is an early predictive biomarker of acute kidney injury after cardiac surgery[J].Kidney Int,2011,70(1):199-203.

[10]Lee H,Nho D,Chung HS,et al.CD4+CD25+regulatory T cells attenuate cisplatin-induced nephrotoxicity in mice[J].Kidney Int,2010, 78(11):1100-1109.

[11]Zhang B,Ramesh G,Norbury CC,et al.Cisplatin-induced nephrotoxicity is mediated by tumor necrosis factor-alpha produced by renal parenchymal cells[J].Kidney Int,2011,72(1):37-44.

[12]廖長秀,汪 暉,彭仁琇,等.阿魏酸鈉對甘油致小鼠腎臟氧化性損傷的拮抗效應[J].藥學學報,2010,38(12):900-903.

Changes and significance of IL-18,TNF-α and CRP in glycerol-induced acute kidney injury in rats.

YANG Hao-qiang,HUANG Xiang-yang,MENG Xiao-yan,ZHANG Min,TAN He-chang.Department of Nephrology,Liuzhou Worker's Hospital,Liuzhou 545005,Guangxi,CHINA

ObjectiveBy detecting changes of interleukin-18(IL-18),tumor necrosis factor-α(TNF-α)and C-reactive protein(CRP)in rat models with glycerol-induced acute kidney injury,to discuss whether inflammatory reaction is involved in this pathogenesis.MethodsForty male SD rats were selected and divided into glycerol experimental group(GL group,n=32)and the normal saline control group(NS group，n=8)randomly.GL group was further divided into 4 groups(24 h group,48 h group,72 h group,96 h group,with 8 rats in each group)based on 4 time points.The serum creatinine(Scr),IL-18,TNF-α,CRP were detected at each time point and analyzed statistically to observe the pathological changes of rat kidney.ResultsCompared to NS group,the levels of Scr,IL-18,TNF-α, CRP were all significantly higher(P＜0.05),and that the renal tubule degeneration was significant.ConclusionIn rats with glycerol-induced acute kidney injury,the levels of IL-18,TNF-α,CRP were all significantly increased,which in-dicates that inflammatory reaction is involved in the pathogenesis.Renal tubule is the main target site of glycerol-induced acute kidney injury.

Glycerol;Acute kidney injury;Inflammatory factor

R-332

A

1003—6350（2015）17—2506—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.17.0909

2015-01-16)

黃向陽。E-mail：930298076@qq.com