BGC-823胃癌細胞凋亡相關蛋白受miR-421調控后的表達分析

浦雄勇，姚永良，孫王偉，蔣一彪，吳建紅

(江蘇大學附屬昆山醫院檢驗科，江蘇 昆山 215300)

BGC-823胃癌細胞凋亡相關蛋白受miR-421調控后的表達分析

浦雄勇，姚永良，孫王偉，蔣一彪，吳建紅

(江蘇大學附屬昆山醫院檢驗科，江蘇 昆山 215300)

目的 研究miR-421在胃癌BGC-823細胞凋亡過程中的分子機制。方法通過siRNA轉染技術將miR-421 mimics與miR-421 inhibitors轉染BGC-823胃癌細胞；Western blotting方法分析細胞凋亡相關蛋白caspase-3、Bax、Bcl-2以及細胞凋亡受體蛋白TNFR-Ⅰ、TNFR-Ⅱ的表達水平。結果miR-421 mimics與miR-421 inhibitors成功轉染BGC-823胃癌細胞；caspase-3、Bax蛋白在miR-421 inhibitors轉染細胞中表達增強，而Bcl-2、TNFR-Ⅰ與TNFR-Ⅱ則表達降低。結論miR-421在BGC-823胃癌細胞中可能通過調控腫瘤細胞凋亡相關蛋白caspase-3、Bax、Bcl-2的表達及腫瘤細胞表面凋亡受體蛋白TNFR的表達從而影響BGC-823的凋亡。

胃癌；miR-421；轉染

微小RNA(microRNA，miRNA)是一種非編碼的小RNA，其堿基長度為20～22 bp，可通過堿基配對方式引導沉默復合體(RNA-induced silencing complex，RISC)降解mRNA或抑制mRNA的翻譯，最終調控蛋白的表達[1]。MiRNA在多種癌組織中均有一定程度的異常表達，并且這些miRNA直接或間接的影響著腫瘤細胞的增殖與凋亡，以上提示miRNA可能發揮著類似原癌基因或抑癌基因的功能[2]。胃癌是人類常見的一種惡性腫瘤，目前眾多研究在胃癌中發現了大量的異常表達的miRNA，表明miRNA在胃癌的發生、發展過程中可能發揮著重要作用。臨床研究表明miR-421在不同種類及不同分化類型的胃癌細胞中表達水平均顯著升高，并且在胃癌早期即異常表達，提示其可能有助于早期胃癌的診斷。本研究通過miR-421在胃癌細胞BGC-823中的表達，探討其與細胞凋亡相關蛋白的作用及其對細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 BGC-823細胞系購自上海中科院細胞庫；DMEM細胞培養基、小牛血清購自HyClone公司；ImagenFect RNAi轉染試劑盒購自無錫納奧生物醫藥有限公司；預染蛋白相對分子質量(Mr)marker、Cocktail蛋白酶抑制劑均購自Fermantas公司。Caspase-3、Bax、Bcl-2、TNFR-Ⅰ、TNFR-Ⅱ、GAPDH抗體購自武漢博士德生物科技有限公司。MiR-421 mimics、miR-421 inhibitors及miR-421陰性序列由上海吉瑪醫藥生物技術公司合成。

1.2 細胞培養 BGC-823細胞于10%小牛血清，100 μg/μl青霉素-鏈霉素雙抗的EMEM細胞培養基中，37℃，5%CO2，飽和濕度環境中傳代培養，而轉染用的細胞培養基不添加青霉素-鏈霉素雙抗。

1.3 細胞轉染 BGC-823胃癌細胞于12孔細胞培養板中培養24 h，當細胞密集度達80%后，磷酸鹽緩沖液(PBS)輕輕漂洗BGC-823細胞并加入500 μl OpitMEM培養液于細胞培養板孔中。同時將20 pmol的miR-421 mimics、miR-421 inhibitors及negative miRNA分別加入50 μl OpitMEM中；然后再分別加入含5 μl IR試劑的50 μl OpitMEM，微型振蕩器震蕩10 s，室溫靜置20 min，再加入12孔細胞培養板中，培養6 h后更換細胞培養基，繼續培養24 h。免疫熒光倒置顯微鏡下觀察miRNA的轉染效果。

1.4 Western blotting 收集各組經miR-421 mimics、miR-421 inhibitors、negative miRNA轉染后的BGC-823胃癌細胞，PBS洗滌2次，1 000 r/min，離心5 min棄上清，加入100 μl預冷的RIPA細胞裂解液，冰上放置40 min。4℃ 12 000 r/min離心15 min，Bradford方法測定蛋白濃度。取各處理組變性蛋白50 μl，于10%的SDS-PAGE膠電泳，轉膜后以含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，二抗37℃孵育1 h，ECL作用后，X線膠片曝光成像，經Image J軟件定量分析。

1.5 統計學方法 應用SPSS16.0統計軟件進行數據分析，兩組間比較采用t檢驗，多組間兩兩比較采用Scheffe法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 siRNA轉染BGC-823細胞 通過Imagen-Fect RNAi試劑盒將miR-421 mimics、miR-421 inhibitors、negative miRNA轉染BGC-823胃癌細胞24 h。免疫熒光倒置顯微鏡下觀察siRNA轉染BGC-823細胞效果(圖1)，大多數BGC-823細胞發出綠色熒光，表明siRNA轉染成功且效率較高。

圖1 siRNA轉染BGC-823胃癌細胞結果

2.2 BGC-823細胞凋亡相關蛋白分析 miR-421 mimics、miR-421 inhibitors及negative miRNA分別轉染胃癌BGC-823細胞24 h后，Western blotting分析細胞凋亡相關蛋白Caspase-3、Bax及Bcl-2的表達水平(圖2)，獨立重復三次實驗，Image J掃描其灰度并經GAPDH灰度值校正后SPSS16.0軟件統計分析。實驗結果表明miR-421 mimics轉染BGC-823后，Caspase-3、Bax蛋白表達分別顯著下調1.23倍、1.45倍，而Bcl-2則表達顯著上調2.12倍，有統計學意義(t=1.833，P＜0.05)；miR-421 inhibitor轉染BGC-823細胞后Caspase-3、Bax表達分別上調2.38倍、3.39倍，而Bcl-2蛋白表達顯著下調1.21倍，差異有統計學意義(t=1.613，P＜0.05)。

2.3 siRNA轉染對BGC-823細胞腫瘤壞死因子受體的影響 MiR-421 mimics、miR-421 inhibitors及negative miRNA分別轉染胃癌BGC-823細胞24 h后，Western blotting分析細胞表面腫瘤壞死因子受體TNFR-Ⅰ與TNFR-Ⅱ的表達水平(圖3)，獨立重復三次實驗，Image J掃描其灰度并經GAPDH灰度值校正后，SPSS16.0軟件統計分析。實驗結果表明miR-NA-421 mimics轉染胃癌BGC-823細胞后，TNFR-Ⅰ與TNFR-Ⅱ表達分別顯著上調1.11倍、2.32倍，差異有統計學意義(t=1.301，P＜0.05)；而miRNA-421 inhibitors轉染BGC-823細胞后TNF-Ⅰ與TNFR-Ⅱ表達則分別顯著減弱1.09倍、1.54倍，差異有統計學意義(t=1.555，P＜0.05)。

圖2 Western blotting分析miR-421 mimics、miR-421 inhibitors及negative miRNA轉染BGC-823細胞后caspase-3、Bax及Bcl-2蛋白表達水平

圖3 Western blotting分析miR-421 mimics、miR-421 inhibitors及negativemiRNA轉染BGC-823細胞后TNFR-I與TNFR-II的表達結果

3 討論

Caspase-3蛋白在細胞Fas/FasL信號系統中，可經一系列激酶的作用而活化，或通過切割作用底物從而誘導腫瘤細胞的凋亡。現有的研究結果表明Caspase-3在侵襲性胃癌細胞中的表達強度比原癌細胞高，其表達程度與腫瘤的惡性程度及分化程度密切相關[3]。MiRNA mimics是通過化學方法合成微小RNA，其轉染到細胞內可模擬細胞內源miRNA從而增強內源miRNA的功能；同樣miRNA inhibitors也是經化學方法修飾過后具有抑制靶細胞miRNA的微小miRNA[4]。研究人員認為腫瘤中的miRNA可能是癌基因的促進因子，反之亦然。Caspase-3在胃癌細胞中的低表達可能與miR-421的過表達密切相關，本研究認為miR-421可能抑制Caspase-3的表達導致胃癌細胞的無序增殖。

Bax和Bcl-2兩種蛋白在細胞凋亡的過程中發揮著重要作用，然而多數的細胞凋亡誘導因子均通過Caspase蛋白介導的信號傳導途徑誘導細胞凋亡[5]。本課題通過miR-421inhibitors、miR-421 mimics轉染BGC-823細胞后，對Caspase-3、Bax及Bcl-2蛋白的表達進行分析，實驗結果表明BGC-823細胞中的miR-421可調控Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白的表達。TNFR-Ⅰ與TNFR-Ⅱ在胃癌細胞中的陽性率明顯高于胃癌細胞鄰近的黏膜和正常黏膜組織，TNF-α/TNFR-Ⅰ信號在腫瘤微環境中的活化從而維持腫瘤細胞的未分化狀態，促進胃癌的發展。本研究結果表明miRNA-421可增強TNFR-Ⅰ與TNFR-Ⅱ在BGC-823細胞的表達，但miRNA-421調控BGC-823胃癌細胞凋亡相關蛋白表達的具體機制仍需深入研究。

[1]Zeng Y,Wagner EJ,Cullen BR.Both natural and designed microRNAs can inhibit the expression of cognate mRNAs when expressed in human cells[J].Mol Cell,2002,9(6):1327-1333.

[2]Gailhouste L,Ochiya T.Cancer-related microRNAs and their role as tumor suppressors and oncogenes in hepatocellular carcinoma [J].Histol Histopathol,2013,28(4):437-451.

[3]Hoshi T,Sasano H,Kato K,et al.Immunohistochemistry of Caspase-3/cpp32 in human stomach and its correlation with ceil proliferation and apoptosis[J].Anticancer Res,1998,18(6A):4347-4353.

[4]Tang G,Tang X.Short tandem target mimic:a long journey to the engineered molecular landmine for selective destruction/blockage of microRNAs in plants and animals[J].J Genet Genomics,2013, 40(6):291-296.

[5]Wei MC,Zong WX,Cheng EH,et al.Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death[J].Science,2001,292(5517):727-730.

Expression analysis of related proteins in the apoptosis of BGC-823 gastric cancer cells regulated by miR-421.

PU Xiong-yong,YAO Yong-liang,SUN Wang-wei,JIANG Yi-biao,WU Jian-hong.Department of Clinical Laboratory, Kunshan People's Hospital Affiliated to Jiangsu University,Kunshan 215300,Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo study the molecular mechanism of miR-421 in the apoptosis of BGC-823 gastric cancer cells.MethodsmiR-421 mimics and miR-421 inhibitors were transfected into BGC-823 cells by siRNA transfection technology.The expression of proteins related to apoptosis or receptors such as caspase-3, Bax,Bcl-2,TNFR-Ⅰand TNFR-Ⅱwere detected by Western blotting.ResultsThe miR-421 mimics and miR-421 inhibitors were transfected into BGC-823 cells successfully.The expression of caspase-3 and Bax proteins were enhanced in BGC-823 cells transfected with miR-421 inhibitors,while the expression of Bcl-2,TNFR-Ⅰand TNFR-Ⅱwere decreased.ConclusionThe expression of apoptosis proteins caspase-3,Bax,Bcl-2 and cell surface receptor proteins TNFR are regulated by miRNA-421 to influence the apoptosis of BGCe-823 gastric cancer cells.

Gastric cancer;miR-421;Transfection

R735.2

A

1003—6350（2015）17—2500—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.17.0907

2015-02-23)

昆山市科計劃項目（編號：KS1347）

吳健紅。E-mail:ejian7054@sohu.com