HPLC法測(cè)定宜昌胡頹子根中槲皮素的含量*

楊林 謝瑤 孫志偉 秦文

胡頹子屬（Elaeagnus L）植物在全世界約有80余種，在我國約有55種，是胡頹子科中種類最多，分布最廣的屬，其主要分布在長江流域及其以南地區(qū)，植物資源比較豐富[1-2]。和沙棘屬植物相比，胡頹子屬植物資源更為豐富，其中很多品種除了具有藥食兩用價(jià)值外，還具有環(huán)保價(jià)值和觀賞價(jià)值。目前針對(duì)胡頹子屬的植物資源研究，國內(nèi)主要圍繞其生藥學(xué)、分布學(xué)等方面，國外則更側(cè)重于分子生物學(xué)和其共生根瘤菌的研究[3-4]。

宜昌胡頹子為胡頹子科胡頹子屬常綠灌木，又名羊奶子、紅雞踢香。宜昌胡頹子集食用、藥用和觀賞價(jià)值于一體，是非常珍貴的藥食兩用植物。其果實(shí)含有豐富的鉀，可調(diào)節(jié)人體的血液滲透壓，可作為飲料補(bǔ)充人體的無機(jī)鹽損失。其根、葉和果實(shí)均可入藥，常用于治療肺虛氣短、疥瘡、痢疾、吐血、腦血栓等疾病[5]。同時(shí)宜昌胡頹子容易修剪，外形漂亮，常作為庭院觀賞植物。

近年來隨著人們對(duì)胡頹子屬植物的關(guān)注和深入研究，其更多的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值被人們所發(fā)現(xiàn)。雖然對(duì)胡頹子屬植物的次生代謝產(chǎn)物的研究在國外有了一定進(jìn)展，而國內(nèi)卻少有人探究，尤其是對(duì)宜昌胡頹子的研究更少，主要集中在生藥學(xué)、栽培種植和藥用價(jià)值等方面[6-8]。除了少量關(guān)于微量元素成分及揮發(fā)油的分析研究外，藥理作用和化學(xué)成分的研究報(bào)道少之又少[9-13]。因此，為進(jìn)一步推動(dòng)我國胡頹子屬植物資源的更深層次利用和開發(fā)，本文采用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)宜昌胡頹子根中的槲皮素含量進(jìn)行了測(cè)定，以期為該品的質(zhì)量評(píng)價(jià)、質(zhì)量控制及進(jìn)一步開發(fā)利用提供一定的科學(xué)依據(jù)，為今后更好綜合利用開發(fā)宜昌胡頹子的植物資源提供參考，現(xiàn)具體報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 Agilent1200高效液相色譜儀，Agilent G1314 VWD檢測(cè)器，HP化學(xué)工作站（美國Agilent公司）；Sartorius BT224S電子天平（北京賽多力斯儀器公司）；BNX-1000超聲波清洗儀（蘇州比能信電氣有限公司）。胡頹子根采自湖北宜昌市秭歸縣，經(jīng)湖北三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院楊先哲副教授鑒定為真品，標(biāo)本現(xiàn)存于湖北三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)標(biāo)本室。槲皮素對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100081-200908）；甲醇為色譜純（美國Tedia公司），其他試劑均為分析純，水為自制重蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Promosil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為：甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B）；洗脫程序：0~35 min，流動(dòng)相A相的比例由38%上升至95%；流速1 mL/min；檢測(cè)波長238 nm；柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備 （1）對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備：精密稱取槲皮素對(duì)照品10 mg，置100 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。（2）對(duì)照品溶液的制備：精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液2.5 mL，置10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。1.2.3 供試品溶液的制備 將宜昌胡頹子根干燥并粉碎，過60目篩。稱取宜昌胡頹子根干粉4.0 g置于50 mL燒瓶中，先用32 mL石油醚于50 ℃回流提取1.5 h，濾過；濾渣中再加入24 mL石油醚于50 ℃回流提取1 h，減壓過濾，收集濾液，揮干石油醚，干燥，備用[14]。精密稱取上述方法脫脂的胡頹子根粉末約1.0 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入25%鹽酸-75%乙醇（1：4）混合溶液50 mL，稱定重量，加熱回流1.5 h，放冷，再稱定重量，用75%乙醇補(bǔ)足失重，搖勻、濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

1.2.4 HPLC法各項(xiàng)性能檢測(cè) （1）系統(tǒng)適用性：取供試品溶液和對(duì)照品溶液各10 μL，按“1.2.1”條色譜條件檢測(cè)。（2）線性關(guān)系：精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0、2.0、3.0、4.0和 5.0 mL，，分別置 10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.2.1”條色譜條件測(cè)定，以槲皮素峰面積A為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度ρ為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。（3）精密度：精密吸取上述對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，按“1.2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定。（4）穩(wěn)定性：取“1.2.2”項(xiàng)下供試品溶液，分別于制備后第0、2、4、6、8 h進(jìn)樣，每次10 μL，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。（5）重復(fù)性：稱取5份同一批宜昌胡頹子根粉末各約1 g，精密稱定，分別按“1.2.3”項(xiàng)下方法平行制備5份供試品溶液，再按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積并計(jì)算樣品含量。（6）加樣回收率：取已知槲皮素含量（1.27 mg/g）的胡頹子根粉末各約1.0 g，精密稱定，照“1.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，總共9份，分別精密加入對(duì)照品儲(chǔ)備液2、2.5、3 mL，各3份，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，計(jì)算回收率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行線性回歸分析。

2 結(jié)果

HPLC法各項(xiàng)性能均較好，（1）系統(tǒng)適用性：槲皮素對(duì)照品與其他色譜峰分離良好，理論板數(shù)大于5000（圖1）。（2）線性關(guān)系：其回歸方程為A=23931ρ+54.3，相關(guān)系數(shù)r=0.9999，表明在10~50 μg/mL范圍內(nèi)槲皮素質(zhì)量濃度ρ與峰面積A值呈良好的線性關(guān)系。（3）精密度：計(jì)算槲皮素峰面積的RSD為0.03%，表明方法精密度良好。（4）穩(wěn)定性：計(jì)算槲皮素峰面積的RSD為1.02%，表明供試品溶液在室溫放置8 h穩(wěn)定性良好。（5）重復(fù)性：樣品平均含量為1.27 mg/g，RSD=1.68%，表明該方法重復(fù)性良好。（6）加樣回收率：平均回收率為99.66%，RSD=0.67%，見表1。

圖1 高效液相色譜圖注：A為對(duì)照品，B為供試品

3 討論

3.1 流動(dòng)相選擇 本實(shí)驗(yàn)采用甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-水和乙腈-0.1%磷酸等多種配比的流動(dòng)相進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，使用乙腈-水體系時(shí)，出峰時(shí)間較早，峰形較鈍。當(dāng)采用洗脫能力較弱，黏度較大的甲醇-水體系洗脫時(shí)，各峰分離度顯著提高。為了進(jìn)一步使峰形改善，筆者在流動(dòng)相中使用了磷酸溶液，結(jié)果顯示當(dāng)磷酸的體積分?jǐn)?shù)達(dá)到0.1%時(shí)，各峰峰形對(duì)稱，且分離度均大于2.0，故確定甲醇-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.2 梯度洗脫依據(jù) 當(dāng)采用等度洗脫時(shí)，槲皮素的分離度和理論踏板數(shù)并不理想，相鄰色譜峰之間分離度≤1.2，而改用梯度洗脫后槲皮素峰的分離效果顯著提高，理論塔板數(shù)大于6000，相鄰色譜峰間分離度良好，保留時(shí)間適中，故確定使用梯度法進(jìn)行洗脫[15-16]。

3.3 最大吸收波長的選擇 筆者對(duì)槲皮素對(duì)照品溶液與宜昌胡頹子根供試品溶液分別進(jìn)行了紫外吸收光譜掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者均在238 nm波長附近有最大吸收，故確定檢測(cè)波長為238 nm。

3.4 宜昌胡頹子粗粉的處理 宜昌胡頹子中的揮發(fā)油是宜昌胡頹子中一類含量較高的成分，如果采取醇直接提取宜昌胡頹子中的黃酮類成分，不僅導(dǎo)致黃酮類成分提取不充分，也無法保證HPLC測(cè)定時(shí)進(jìn)樣量的一致。因此本實(shí)驗(yàn)中，筆者采用石油醚預(yù)先脫去宜昌胡頹子根干粉中的油脂，可提高黃酮類化合物的提取率和測(cè)定的準(zhǔn)確性[17]。

3.5 供試品溶液的制備方法及提取溶劑的選擇 由于宜昌胡頹子中槲皮素主要以苷的形式存在，經(jīng)醇直接提取后進(jìn)行HPLC測(cè)定，含量將無法達(dá)到HPLC的最低檢測(cè)限要求，故必須經(jīng)過酸水解將苷轉(zhuǎn)化為苷元后再進(jìn)行測(cè)定[18]。因此，在提取過程中，采用鹽酸將苷完全轉(zhuǎn)化為苷元后再進(jìn)行HPLC測(cè)定，槲皮素含量顯著提高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用25%鹽酸-75%乙醇（1∶4）提取的槲皮素含量較高，色譜峰分離度好，故選用25%鹽酸-75%乙醇（1∶4）作為提取溶劑[19]。

湖北擁有豐富的胡頹子資源，但沒有現(xiàn)成的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)宜昌胡頹子進(jìn)行質(zhì)量控制，本文采用HPLC法測(cè)定槲皮素的含量，方法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，為完善和提高宜昌胡頹子的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供了科學(xué)的依據(jù)。

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