三氧化二砷對食管癌細胞株EC-1的生長抑制作用*

谷見法 王曉敏 路平

中藥砒霜的有效成份即為三氧化二砷（As2O3），可使急性早幼粒細胞白血病臨床緩解率達到80%以上[1-2]。許多研究證實，As2O3對多種實體瘤如肝癌[3]、乳腺癌細胞[4-5]、胃癌[6]、骨髓瘤[7]、淋巴瘤[8]、腎母細胞瘤[9]等都有明顯的增殖抑制作用。但在食管癌[10]方面，相關研究報道較少見。而食管癌是我國常見腫瘤[11]。本研究探討食管癌EC-1細胞在三氧化二砷作用的變化，并尋找其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人食管癌細胞株EC-1細胞。

1.1.2 主要儀器 MULTISKAN MK3酶標儀（美國 Thermo electron公司）恒溫細胞培養箱（英國RSBionch公司）；Epic XL II型里流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司），倒置顯微鏡（EE 2000-U）（日本Nikon公司），OLYMPUS直立光照照相系統（日本Olympus公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 EC-1細胞增殖反應檢測 采用MTT法，實驗根據三氧化二砷濃度分八組：64、32、、16、8、4、2、1、0.5 μmol/L。以每孔6×l03個細胞接種在96孔板內，細胞貼壁后，加入用上述不同最終濃度的As2O3，放入孵箱繼續培養。觀察24、48、72 h后取出培養板，每孔加入MTT液20 uL，繼續孵育4 h，棄內液。每孔再加入二甲亞礬，放在震蕩混合儀上常溫震蕩10 min。在酶標儀讀取492 nm的吸光度（OD），計算抑制率。實驗取3個平行孔，重復3次，取平均值。抑制率（%）=1-（實驗組平均OD值/對照組OD值）×100%。

1.2.2 流式細胞儀分析細胞周期及凋亡 取在指數生長期的EC-1細胞，把細胞濃度調整為1×105/mL接種6孔培養板內，接種后24 h后，實驗組加三氧化二砷處理。48 h培養后，消化離心成單細胞懸液，冷PBS洗滌兩次。PBS打散制成細胞懸液，加進5 μL RNA酶（10 mg/mL），放在37 ℃水中1 h。加入50 μL碘化丙啶，30 min避光染色，400目篩網濾過后，樣品在流式細胞儀在488 nm處檢測。

1.3 統計學處理 采用軟件SPSS 17.0對數據進行統計學分析，計量資料以（±s）表示，兩樣本均數比較采用t檢驗，多樣本均數比較采用單因素方差分析，檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 MTT法檢測As2O3對EC-l的增殖抑制作用 MTT法檢測不同濃度（64、32、16、8、4、2、l、0.5 μmol/L）的As2O3對食管癌EC-1細胞作用24、48、72 h后的增殖抑制作用，結果顯示：隨濃度升高，抑制作用增強，隨作用時間延長，抑制作用增強，即存在量效和時效關系。圖1可見，抑制率與As2O3濃度表現出梯度變化的曲線關系，并求出As2O3作用食管癌EC-1細胞48 h的半數抑制率（IC50）為18.74 μmol/L。圖中也可見細胞抑制率為50%時對應的藥物濃度大致為19 μmol/L。

圖1 三氧化二砷對食管癌EC-1細胞的抑制作用

2.2 流式細胞儀分析細胞周期及凋亡 為探討As2O3對人食管癌EC-1細胞作用機制，以流式細胞儀檢測各組細胞的細胞凋亡改變及細胞周期分布的變化。表1可見As2O3可使細胞阻滯在G2/M期，使G0/G1期、S期細胞比例減少，增加細胞凋亡。

表1 不同處理組細胞凋亡檢測結果（x-±s）

3 討論

中藥砒霜的主要組分即為As2O3，其用于治療疾病已有源遠流長的歷史，但其毒性大，限制了在臨床上的廣泛使用。在上世紀70年代，國內學者應用主要成分為As2O3的癌靈1號在急性早幼粒細胞白血病療效顯著。隨后更多的學者開始進行實體瘤的基礎與臨床研究，在食管癌方面，景紹武[12]發現As2O3能增加放療對食管癌細胞株Eca109增殖的抑制作用。

筆者在實驗中發現MTT法檢測了不同濃度對食管癌EC-1細胞的增值抑制的結果顯示：As2O3對食管癌EC-1細胞具有抑制增殖作用，且隨時間延長，劑量增加而抑制作用更明顯，即呈時效和劑效關系，與景紹武[12]用As2O3作用于食管癌細胞株Eca109的研究結果符合。

本實驗經流式細胞術檢測細胞周期及凋亡，結果表明 As2O3主要使細胞周期在G2/M期阻滯，G0/G1期細胞減少，與Ling等[13]同在肺癌、卵巢癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞系，李嵐[14]在胃癌BGC-823細胞研究結果符合。但也有研究報告As2O3在多發性骨髓瘤細胞中，細胞在G2/M期及G1期阻滯[15]，這可能與不同細胞系有關。綜上所述，As2O3對食管癌EC-1細胞有抑制作用，為以后的動物實驗和臨床研究提供依據。

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