血管性癡呆與神經束蛋白155的相關性研究*

趙騰 陳海龍 劉晶瑤 孫莉 周春奎

血管性癡呆（Vascular dementia，VD）指的是出血性、缺血性以及急性和慢性缺血缺氧性腦血管疾病所導致的腦組織損傷進而誘發的認知功能障礙的一種臨床綜合征，其發病機制尚未完全清楚[1-2]。研究探討其發病機制并在此基礎上有針對性地進行適當干預對于預防血管性癡呆具有非常重要的意義。有研究顯示白質脫髓鞘是VD的發病機制之一，而神經束蛋白155（Neurofascin155，NF155）在保持髓鞘的穩定中起到了關鍵的作用，NF155缺失會造成軸突-膠質間隔樣連接消失，從而降低神經傳導的速度[4-6]。本研究通過對慢性缺血致血管性癡呆大鼠腦內NF155的水平進行分析，旨在進一步明確慢性缺血是否通過影響NF155，進而破壞髓鞘的穩定性，從而出現血管性癡呆。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2013年12月-2014年5月期間選擇清潔級雄性Wistar大鼠40只，大鼠的質量為250~300 g，由吉林大學白求恩醫學院實驗動物中心提供及喂養，實驗動物生產許可證：SCXK（吉）2012-0005，實驗動物使用許可證：SYXK （吉）2012-0012，實驗在吉林大學基礎實驗室進行。

1.2 實驗動物分組及模型制備 實驗動物進行Morris水迷宮檢測，檢測期間統計40只大鼠在6 d里的訓練成績，其總平均潛伏期為（30.85±9.45）s，期間死亡1只，另有3只大鼠不符合標準。將大鼠隨機分為假手術對照組12只，模型組24只（30 d組12只，60 d組12只）。大鼠稱重，按10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉，采用2VO法復制慢性前腦缺血致血管性癡呆的動物模型。假手術對照組除不結扎、不剪斷頸總動脈，其余過程與模型組相同。造模后第5天開始水迷宮試驗，5次/d，2 min次/，共5 d。測試第3天，開始記錄成績，如測試第5天，逃避潛伏期仍超過20 s或2次誤入其他盲端即為血管性癡呆模型。術后30 d和60 d將模型組大鼠和相應對照組大鼠用10%水合氯醛麻醉。然后在冰盤上快速斷頭取腦，將出腦組織置于玻璃勻漿器中研磨，2000 r/min離心15 min，取上清，無菌過濾后-80 ℃保存備用。

1.3 NF155的檢測方法 標準品按以下濃度稀釋：3 ng/mL、6 ng/mL、12 ng/mL、24 ng/mL、48 ng/mL。（NF155抗體，產地：中國上海，規格：1.0 g），分別設定樣品孔、標準品孔和空白孔。將稀釋后的不同濃度標準品加入準品孔中，樣本孔內先加入10 μL待測樣本，然后用稀釋液稀釋5倍，空白孔不加。各樣本孔和標準品中每孔均加入100 μL辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體，封板膜密封，37 ℃水浴60 min。棄去液體后拍干，加洗滌液300 μL/孔，靜置1 min后拍干，如此重復5 次，然后拍干。分別加入底物A和底物B 50 μL/孔，37 ℃避光孵育15 min。取出酶標板，加終止液終止反應50 μL/孔。以空白孔調零，在450 nm波長下測量各孔的吸光度值（OD值）。終止后15 min內檢測完成，以標準品的濃度和OD值作標準曲線，然后根據樣品的OD值和標準曲線所對應的公式計算出NF155的濃度值即可。

1.4 統計學處理 使用SPSS 20.0統計軟件進行分析，計量資料用（±s）表示，比較采用t檢驗，各組間樣本均數行方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組的Morris水迷宮結果比較 造模前水迷宮實驗發現，模型組小鼠逃避潛伏期與假手術對照組之間的差異沒有統計學意義（P>0.05）。造模后水迷宮實驗發現，術后30 d組第6天開始，大鼠逃避潛伏期均明顯長于假手術組，差異有統計學意義（P<0.05）；術后60 d組第5天開始，逃避潛伏期均明顯長于假手術組，差異有統計學意義（P<0.05），見表1~2。

表1 造模前水迷宮結果比較（x-±s） s

表2 造模后水迷宮比較（x-±s） s

2.2 各組的NF155檢測結果比較 經檢測，假手術對照組的NF155濃度為（85.07±6.75）ng/mL，術后30 d組的NF155濃度為（48.27±7.32）ng/mL，術后60 d組的NF155濃度為（37.65±6.88）ng/mL，比較分析發現，術后30 d組和術后60 d組的NF155濃度均明顯低于假手術對照組，差異均有統計學意義（t=12.803、7.043，P=0.000、0.000）；而術后30 d組NF155濃度又明顯高于術后60 d組，兩組比較差異有統計學意義（t=3.662，P=0.001）。

3 討論

血管性癡呆的發病原因主要是由缺血性、缺氧性、出血性腦血管病等導致腦組織損害引起的，其主要臨床特征是認知功能障礙，臨床上患者通常表現為認知能力減退、學習能力和記憶功能衰退以及行為障礙等[7]。隨著我國人口老齡化程度加深，腦血管病發病率以及血管性癡呆的發病率逐漸上升。臨床流行病學研究資料顯示，我國血管性癡呆的發病率明顯高于阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD），不僅嚴重危害老年人生活質量，同時也給患者的家庭和社會帶來沉重的負擔[8]。國外研究顯示VD是防治癡呆的主要突破口，因此探討其發病機制同時尋求切實有效的治療方法是解決這一問題的關鍵[9]。

前期病理研究表明，當慢性腦缺血大鼠額、顳葉皮質神經細胞以缺血性改變為主時，腦白質會出現神經纖維斷裂及髓鞘脫失的改變，證明全腦缺血的大鼠腦白質損傷也是重要的病理改變之一[10-12]。因此本課題專注于研究慢性腦缺血所致血管性癡呆大鼠白質相關的改變。

神經束蛋白（Neurofascin，NF）是由腦內膠質細胞產生的一種細胞表面蛋白，根據分子量不同可分為NF-l86和NF-155。其中，NF-155屬于免疫球蛋白家族中L1亞群中的細胞黏附分子，分子量155kD[13]。國內外研究表明，NF155在髓鞘的穩定中具有重要的作用[14]。因此，其在腦白質損傷（Cerebral white matter lesion，CWML）性疾病中的作用受到了研究者越來越多的重視。然而，目前對NF155的研究主要集中于多發性硬化及急性缺血性腦損傷，對于NF155與蛋白質疾病關系之類的報道極少，NF155與慢性腦缺血致血管性癡呆的相關性研究尚未見報道[15]。然而，結合慢性缺血后腦白質損傷的病理學改變，推測在維持髓鞘的結構及功能的穩定中起關鍵作用的NF155在慢性缺血腦組織中的含量肯定發生了實質性變化，因而選擇NF155作為研究血管性癡呆的相關性因子是可行的。通過本研究結果證實，術后30 d組和術后60 d組的大鼠的逃避潛伏期均明顯長于假手術對照組，且慢性前腦缺血致血管性癡呆大鼠腦內NF155的含量較假手術對照組明顯降低，數據顯示隨著大鼠癡呆程度加深，NF155的表達量逐漸減少，表明VD大鼠認知功能、記憶功能減退可能與NF155的減少有關，表明NF155的減少與血管性癡呆的發生具有一定的相關性，推測NF155參與了血管性癡呆的形成過程。

本結論為血管性癡呆的發病機制研究提供了新的靶點，為進一步通過對NF155進行干預從而預防血管性癡呆的發生奠定了基礎。

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