靈芝孢子油抑制前列腺癌LNCaP細胞中AR激活及轉錄活性*

張豫明 班素芬 余雙霞 曾方銀

靈芝孢子油是從靈芝孢子中提取出的具有生物活性的油狀脂質物，含有諸如多糖、三萜類、脂肪酸及微生物等。已有研究證實，靈芝孢子具有提高免疫、抗病毒、降血脂以及抗炎和清除自由基等作用[1-4]。近期研究進一步顯示，靈芝孢子油不僅具有抑制腫瘤生長、促進腫瘤細胞凋亡，而且還抑制腫瘤的遷移和血管生成[5-11]。前列腺癌是男性泌尿生殖系統最常見的惡性腫瘤，近年來隨著生活水平的提高和人的預期壽命不斷延長，前列腺癌的發病率呈顯著上升趨勢。其中，雄激素受體在前列腺癌的發生發展中占有重要地位[12-14]。本研究探討靈芝孢子油對雙氰睪酮（Diydrotestoserone，DHT）誘導的前列腺癌LNCaP增殖、雄激素受體AR的激活和轉錄活性及相關激酶的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM培養基和胎牛血清（Hyclone），PKD1（A-20） 和 AR抗體（Santa Cruz），PKD磷酸化抗體（s744/748）和AR磷酸化抗體（pAR）購自CST；Beta-actin 抗 體（C4）：SC-47778（Santa Cruz），Lipofectamine2000（LIFE公司），雙氫睪酮（DHT）（Sigma公司），聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）所需丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、SDS、Tris及甘氨酸等超純生化試劑等（Promega公司）。人類雄激素受體結合的熒光素酶報告質粒pMMTV-luc（鹿特丹大學醫學中心Dr.Brinkmann惠贈），海腎熒光素酶報告內參照質粒pRL-SV40（Promega公司），雙色熒光素酶報告基因檢測試劑盒（Dual luciferase reporter assay試劑盒）購自Promega公司。

1.2 細胞株和細胞培養 LNCaP細胞（購自上海細胞庫）培養于DMEM完全培養基（10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 ng/mL鏈霉素）中，培養條件為37 ℃，5% CO2。

1.3 細胞增殖檢測 采用CCK-8法檢測細胞增殖活性。簡述如下：LNCaP細胞消化鋪至96孔板中，100 μL/孔，細胞數量為1000/孔。將培養板在37 ℃、5% CO2培養箱預培養過夜，每孔1∶100加入CCK-8溶液，放置培養箱內孵育2~4 h后Bio-Rad model 680 microplate reader酶標儀在450 nm波長處測定吸光度（OD），按如下公式計算細胞活性：細胞增殖活力/%=（處理組OD值-空白對照組OD值）/（對照組OD值-空白對照組OD值）×100%。

1.4 實驗處理及質粒轉染 將LNCaP細胞分三組，即Control組、DHT處理組、DHT和靈芝孢子油共同處理組（DHT+Oil）。將對數期生長的LNCaP細胞按合適的密度和上述分組分別接種于24孔板或6孔板中，過夜后：（1）按上述處理組分別加入Control組（DMSO）、DHT（10 nM）、DHT（10 nM）+Oil（20 μg/mL），24 h后CCK-8檢測細胞增殖活性，Western blot檢測蛋白表達；（2）分別熒光素酶報告質粒pMMTV-luc及海腎熒光素酶報告質粒pRL-SV40轉染上述三組細胞，12 h后分別加入Control組（DMSO）、DHT（10 nM）、DHT（10 nM）+Oil（20μg/mL）處理24 h，收集細胞裂解液進行雙螢光素酶報告基因活性檢測。

1.5 Western blot 收集細胞，加入細胞裂解液于冰上裂解30 min，于4 ℃ 12 000 r/min離心20 min，取上清Bradford法測定蛋白濃度。取等量的蛋白進行SDSPAGE電泳并轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入多克隆抗體，4 ℃過夜。將膜移至HRP標記的二抗（1∶2000）中，室溫孵育1 h。膜置于化學發光液中，曝光、顯影及定影。

1.6 熒光素酶報告質粒pMMTV-AR轉錄活性檢測 參照Promega的Dual-Luciferase雙螢光素酶報告基因檢測系統的說明書分別測定熒光素酶報告質粒pMMTV-luc和海腎熒光素酶報告質粒pRL-SV40的熒光素酶活性，以兩者的相對比值作為熒光素酶相對活性單位（Relative luciferase unit，RLU）。

1.7 統計學處理 條圖的制作和統計均使用Graphpad Prism 5.0軟件，比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 靈芝孢子油降低DHT誘導的LNCaP細胞的增殖和存活 為了探討靈芝孢子油對雄激素依賴的前列腺癌LNCaP細胞生長的抑制作用，筆者檢測了DHT刺激作用下，有無靈芝孢子油處理對前列腺癌LNCaP細胞生長的影響，結果如圖1所示，CCK-8檢測腫瘤細胞增殖活性表明，二氫睪酮（DHT，10 nM）刺激作用下明顯增加LNCaP細胞的增殖活性，而靈芝孢子油處理（20 μg/mL）則明顯降低DHT刺激的LNCaP細胞的增殖活性，與DHT組比較差異均有統計學意義（P<0.01）。

圖1 靈芝孢子油降低DHT刺激的LNCaP細胞的增殖活性*與DHT組比較，P<0.01

2.2 靈芝孢子油降低DHT誘導的 LNCaP細胞中AR的磷酸化激活 雄激素受體（Androgen receptor，AR）的激活是DHT誘導的LNCaP細胞增殖及下游靶基因表達的關鍵。為了明確靈芝孢子油是否抑制DHT誘導的AR的磷酸化激活，筆者同樣檢測了DHT刺激作用下，有無靈芝孢子油處理對前列腺癌LNCaP細胞AR的表達及磷酸化活性的影響，結果表明：DHT刺激明顯增加雄激素受體（AR）的磷酸化活性，而同時靈芝孢子油處理則明顯降低DHT誘導的AR磷酸化激活，而對AR的表達水平無影響，提示靈芝孢子油可能是通過抑制AR的磷酸化而抑制前列腺癌LNCaP細胞的增殖，見圖2。

2.3 靈芝孢子油降低DHT刺激的LNCaP細胞中蛋白激酶D的磷酸化激活 為了探討靈芝孢子油是否抑制DHT誘導的前列腺癌細胞中蛋白激酶D（Protein kinase D，PKD）的磷酸化活性，筆者也檢測了有無靈芝孢子油處理作用下對PKD磷酸化活性的影響，與AR作用相似，DHT刺激明顯增加PKD（ser744/748）的磷酸化活性，而靈芝孢子油處理則明顯降低DHT誘導PKD（ser744/748）的磷酸化活性，對PKD的蛋白表達水平無影響，見圖3。

圖2 靈芝孢子油降低DHT誘導的雄激素受體（AR）

圖3 靈芝孢子油降低DHT誘導的PKD（ser744/748）的磷酸化活性

2.4 靈芝孢子油抑制DHT誘導的LNCaP細胞中AR的轉錄活性 由于靈芝孢子油明顯降低前列腺癌LNCaP細胞中DHT誘導的AR磷酸化激活，而對AR的表達水平無影響，進而筆者利用熒光素酶報告基因檢測了靈芝孢子油是否抑制DHT誘導的LNCaP細胞中AR的轉錄激活。如圖4所示，DHT刺激可增強LNCaP細胞中AR的轉錄活性，而靈芝孢子油則明顯抑制DHT誘導的LNCaP細胞中AR的轉錄激活活性，與DHT組比較差異均有統計學意義（P<0.01）。

圖4 靈芝孢子油抑制DHT誘導的LNCaP細胞中AR的轉錄激活活性*與DHT組比較，P<0.01

3 討論

前列腺癌是老齡男性最常見的非皮膚癌惡性腫瘤，在美國位居男性腫瘤死亡的第二位，而在我國其發病率呈逐年上升趨勢。雄激素受體（AR）的激活是前列腺癌由雄激素依賴性轉變為雄激素非依賴性演進過程的關鍵。雄激素受體是由配體激活的一種轉錄因子，當無配體結合時，AR在胞質內與熱休克蛋白相結合并呈無活性狀態，當雄激素受體與雙氫睪酮（DHT）結合，則與熱休克蛋白解離，繼而進入胞核內與靶基因啟動子區雄激素反應元件（androgen response element，ARE）結合，調節與細胞生長、增殖相關的靶基因表達[12-16]。本研究初步探討了靈芝孢子油對雄激素依賴性前列腺癌LNCaP細胞中DHT誘導的細胞增殖、雄激素受體的激活及轉錄活性的影響，結果顯示：靈芝孢子油不僅降低DHT刺激的LNCaP細胞的增殖活性而且抑制DHT誘導的前列腺癌LNCaP細胞中AR和蛋白激酶D的磷酸化活性，而對其本底蛋白的表達水平無影響。此外，熒光素酶報告基因活性檢測進一步表明靈芝孢子油則明顯抑制DHT誘導的LNCaP細胞中AR的轉錄激活活性。

已有的研究表明，靈芝孢子油具有提高免疫、抗病毒、降血脂以及抗炎和清除自由基等功效[1]。有關靈芝孢子油在抗腫瘤中的功能作用備受人們的關注，其可能的機制包括：激活凋亡效應蛋白Caspase3誘導凋亡，下調miR-21而誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤的血管生成等[6-10]。筆者在前列腺癌雄激素依賴的LNCaP細胞中研究顯示靈芝孢子油降低DHT誘導的LNCaP細胞的增殖活性、雄激素受體的激活和其轉錄活性，提示在前列腺癌中靈芝孢子油可能通過調節AR的激活和轉錄活性而抑制前列腺癌細胞的生長。

雄激素受體（AR）不僅受DHT誘導激活，而且還受到細胞內自分泌生長因子或相關的信號通路的異常激活，AR的激活在前列腺癌發生和進展中發揮著關鍵的作用[16]。近年研究顯示，在雄激素依賴的前列腺癌細胞LNCaP中蛋白激酶（PKD1）過表達，DHT刺激可促使PKD1與AR直接結合于PSA（prostate specific antigen，前列腺特異性抗原）的啟動子區[17]。本研究顯示，靈芝孢子油降低了DHT誘導的前列腺癌LNCaP細胞中AR和蛋白激酶D的磷酸化活性，而對其本底蛋白的表達水平無影響，提示靈芝孢子油可能通過抑制蛋白激酶D的磷酸化而抑制AR的激活，進而抑制AR相關靶基因的表達，但是，靈芝孢子油是否通過抑制蛋白激酶D的磷酸化而抑制AR的核內轉位以及抑制AR哪些靶基因的表達還有待進一步研究。

[1]余素，王勇.靈芝孢子油的研究進展[J].海峽藥學，2013，25（12）：20-23.

[2]胡瞬，易有金，熊興耀，等.靈芝孢子油的研究進展[J].安徽農業科學，2010，38（17）：9214-9215.

[3]李森柱，謝意珍，周靜文，等.靈芝孢子油主要活性成分及降血脂功能的研究[J].中國食用菌，2006，25（5）：40-52.

[4]孫琳，花春艷，侯亞義.靈芝孢子油對人肝癌細胞株HepG2的影響及其機制的初步研究[J].實用腫瘤雜志，2011，26（2）：128-133.

[5]卞嵩，許立，俞云，等.靈芝孢子油對H22荷瘤小鼠腫瘤生長及瘤細胞VEGF表達的影響[J].安徽醫藥，2007，11（12）：1067-1068.

[6]焦春偉，梁慧嘉，簡偉明，等.靈芝孢子油對人惡性乳腺癌細胞MT-1半胱天冬酶-3及細胞凋亡的影響[J].食用菌學報，2014，21（4）：58-60.

[7]趙光鋒，郭葳，趙曉寅，等.靈芝孢子油通過下調miR-21促進人肺腺癌SPC-Al細胞凋亡[J].中國中藥雜志，2011，36（9）：1231-1234.

[8]劉賢欽，竇環，宋玉仙，等.靈芝孢子油對人肺腺癌細胞LTEP-a-2的抑制作用[J].中國藥理學通報，2011，27（1）：146-147.

[9]呂明明，王婷婷，錢倩，等.靈芝孢子油對肺腺癌癌性胸水中原代腫瘤細胞的抗腫瘤作用[J].現代腫瘤醫學，2011，19（7）：1289-1292.

[10]張京，牛苗苗，楊麗，等.靈芝孢子油及靈芝提取物孢子油對乳腺癌血管生成調節因子的作用[J].解剖學報，2014，45（4）：525-530.

[11]宋玉仙，竇環，劉賢欽，等.靈芝孢子油對MCF-7細胞凋亡及遷移的影響[J].中醫藥信息，2011，28（2）：91-94.

[12] Taplin M E.Drug insight：role of the androgen receptor in the development and progression of prostate cancer[J].Nature Clinical Practice Oncology，2007，4（4）：236-244.

[13] Maughan B L，Antonarakis E S.Androgen pathway resistance in prostate cancer and therapeutic implications[J].Expert Opinion on Pharmacotherapy，2015，16（10）：1521-1537.

[14] Munoz J，Wheler J J，Kurzrock R.Androgen receptors beyond prostate cancer：an old marker as a new target[J].Oncotarget，2015，6（2）：592-603.

[15] Ahmed A，Ali S，Sarkar F H.Advances in androgen receptor targeted therapy for prostate cancer[J].Journal of Cellular Physiology，2014，229（3）：271.

[16] Dehm S M，Tindall D J.Regulation of androgen receptor signaling in prostate cancer[J].Expert Review of Anticancer Therapy，2005，5（1）：63-74.

[17] Mak P，Jaggi M，Syed V，et al. Protein kinase D1 （PKD1）influences androgen receptor （AR） function in prostate cancer cells[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2008，373（4）：618-623.