胃癌組織miRNA-433的表達情況及其影響因素分析

沈淑蓉

(溫州市中西醫結合醫院，浙江 溫州 325000)

胃癌組織miRNA-433的表達情況及其影響因素分析

沈淑蓉

(溫州市中西醫結合醫院，浙江 溫州 325000)

目的:分析熒光定量PCR法檢測胃癌血清中miRNA-433的表達情況，探討miRNA-433在胃癌檢測中的意義。方法:設計miRNA-433和U6莖環逆轉錄引物和PCR擴增引物，以U6為內參利用實時熒光定量PCR檢測正常對照組、胃竇潰瘍組、胃竇炎性息肉組及胃癌組的miRNA-433表達情況，并將術前與術后的miRNA-433表達情況進行對比分析。結果:胃癌組患者的miRNA-433表達水平明顯均高于正常對照組、胃竇潰瘍組及胃竇炎性息肉組，具有顯著性差異(P＜0.05)。結論:熒光定量PCR具有特異性強、靈敏度高等優點，可以運用于檢測胃癌的早期診斷和分期，具有廣闊的應用前景，值得進一步推廣。

熒光定量PCR法;血清miRNA-433;表達情況;應用效果

胃癌屬于一種惡性腫瘤，常發生于胃黏膜上皮細胞，其發病率高，給患者的生命健康造成很大的威脅。胃癌的早期診斷的標準為胃鏡及病理學診斷，現今，血清腫瘤標記物(如癌胚抗原)也逐漸開始應用于檢測腫瘤，但其對胃癌診斷的敏感性和特異性相對較低［1-2］。微小RNA(microRNA，miRNA)是一種普遍存在于多種細胞生物中的內源性、非編碼小RNA分子，長19-22個核苷酸，約占基因總數的2%［3］。本研究就熒光定量PCR法在胃癌血清miRNA-433檢測中的應用效果報道如下［1］。

一、材料與方法

(一)材料。

1.標本收集。2010年10月-2012年10月我院收治106例患者。其中30例未經放化療的胃癌患者，其中男17例，女13例，年齡42-67歲，平均年齡為(53.8±8.7)歲;正常人員30例，年齡41-64歲，平均年齡為(51.8±13.5)歲;胃竇潰瘍患者27例，年齡40-66歲，平均年齡為(53.2±14.3)歲;胃竇炎性息肉患者19例，年齡43-63歲，平均年齡為(52.6± 15.7)歲。

2.主要試劑和儀器。Trizol試劑;miRNA-433熒光定量PCR試劑盒;逆轉錄所需的dNTPs及逆轉錄酶、100bp DNAL adder Marker;ABI Prism7000熒光定量PCR儀;Biophotometer生物分光光度計。

(二)方法。

1.總RNA提取。采用Trizo法分別提取胃癌組織、正常組織、胃竇潰瘍組織、胃竇炎性息肉及其癌旁組織的總RNA，Biophotometer生物分光光度計檢測RNA質量和濃度，1.2%的甲醛變性凝膠電泳［2］。

2.實時熒光定量PCR檢測血清中miRNA-433含量。以RNA為模板，分別以miRNA-433和U6反轉錄引物行逆轉錄反應，反轉錄條件為42℃ 60min，85℃ 5s，獲得小鼠肝臟組織的miRNA-433和U6 cDNA。分別以miRNA-433和U6 cDNA為模板，以miRNA-433和U6的特異性引物實時熒光定量PCR，反應參數為95℃10min預變性，95℃15s，60℃30s熒光檢測1次，共40個循環。

(三)統計學分析。

經方差分析發現miRNA-433基因相對表達量不滿足正態分布和方差齊性條件，故只能以M(P25，P75)表示，采用SPSS 17.0軟件進行，并利用Mann-Whitney U檢驗進行組間比較。當P＜0.05為有統計學意義。

二、結 果

胃癌組、胃竇潰瘍組、胃竇炎性息肉組及正常對照組的miRNA-433相對表達量分別為1.99(0.96，2.51)、1.25 (0.97，2.36)、1.31(1.13，2.66)及0.03(0.02，0.05)。胃癌組患者的miRNA-433表達水平明顯均高于正常對照組、胃竇潰瘍組及胃竇炎性息肉組［4］，具有顯著性差異(P＜0.05) (見附表)。

三、討 論

本次實驗采用熒光定量PCR法檢測胃患者血清中的miRNA-433表達情況，設計具有莖環結構的逆轉錄引物和用miRNA熒光標記的特異分子探針進行實時熒光定量PCR。通過熔解曲線的分析結果可以看出基本沒有引物二聚體的形成，證明了反應具有特異性。結果顯示胃癌組患者的miRNA-433表達水平明顯均高于正常對照組、胃竇潰瘍組及胃竇炎性息肉組(P＜0.05)，而正常對照組、胃竇潰瘍組及胃竇炎性息肉組之間相比較則無顯著性差異(P＞0.05);術前miRNA-433表達水平明顯均高于術后，具有顯著性差異(P＜0.05)。這與相關報道一致。綜上所述，熒光定量PCR法可以較為精確顯現出胃癌患者血清中miRNA-433的表達水平，進而為胃癌的早期診斷提供參照指標，具有廣闊的應用前景。

附表 熒光定量PCR檢測miRNA-433在各組血清中的表達情況比較

［1］王君輔，李紅浪，謝 勇，等.循環microRNA在胃癌診斷及預后預測中應用的研究進展［J］.廣東醫學，2012，33(24):3828-3831.

［2］張晟春，王 燕，張興毅，等.兩種熒光定量聚合酶鏈反應法檢測乳腺癌組織中微小RNA-21的應用分析［J］.中國全科醫學，2013，16(20):624-628.

［3］馬文靜，李 魯，呂國棟，等.SYBR green實時熒光定量PCR檢測微小RNA 21的方法建立及在食管鱗癌中的應用［J］.生物技術，2010，20(1):45-48.

［4］陳文璟，溫旺榮.SYBR green I熒光定量PCR檢測宮頸癌血清中miR-21的表達［J］.臨床檢驗雜志，2011，29(7):523-525.

R735

A

1002-1701(2015)07-0126-02

2014-10

沈淑蓉，女，碩士，副主任醫師，研究方向:腫瘤生物學行為研究。

溫州市科技局課題，胃癌淋巴轉移特異性血清microRNA的篩選與鑒定(編號Y20110136)。

10.3969/j.issn.1002-1701.2015.07.066