固相微萃取結(jié)合氣-質(zhì)分析東北大醬的揮發(fā)性成分

孫潔雯，李燕敏，劉玉平*

（北京工商大學(xué)，北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康北京高精尖創(chuàng)新中心，北京 100048）

東北特產(chǎn)大醬是以黑龍江特級(jí)大豆為主要原材料，經(jīng)過選料、烀豆、攪碎、做醬塊、曬醬塊、下醬、倒醬等加工工序，最后制得的半固體狀調(diào)味食品[1]。在加工過程中由于酶的作用，促使豆中更多的磷、鈣、鐵等礦物質(zhì)被釋放出來，提高了人體對(duì)大豆中礦物質(zhì)的吸收率；此外，加工過程中由于微生物作用可合成核黃素等，因此，大醬營(yíng)養(yǎng)比大豆更易于消化吸收[2]。另外，大醬中含有的脂肪成分大部分為不飽和脂肪酸，故膽固醇含量很低，具有提高血液循環(huán)的作用[3]。

近年來對(duì)于醬類調(diào)味品的研究主要集中于工藝的改進(jìn)和微生物的檢測(cè)，如馮治平等[4]采用酶促法對(duì)甜面醬的生產(chǎn)工藝條件進(jìn)行了研究分析，徐鑫等[5]采用16S rDNA的方法對(duì)大醬中耐鹽性乳酸菌進(jìn)行了鑒定。關(guān)于醬中的揮發(fā)性成分報(bào)道較多[6-7]，而關(guān)于東北特產(chǎn)大醬中的揮發(fā)性成分鮮見報(bào)道。固相微萃取（solid phase micro-extraction，SPME）技術(shù)具有操作便捷、樣品用量少的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于各種食品揮發(fā)性成分的檢測(cè)[8]。

本研究采用固相微萃取法結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用分離鑒定東北特產(chǎn)大醬的揮發(fā)性成分，分析比較提取時(shí)間和提取溫度對(duì)揮發(fā)性成分提取效果的影響，旨在較準(zhǔn)確地鑒定出東北特產(chǎn)大醬的揮發(fā)性成分，對(duì)大醬的風(fēng)味及形成機(jī)理進(jìn)行研究，為大醬的風(fēng)味評(píng)價(jià)及工藝改進(jìn)提供更好的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大醬：黑龍江省雙城市某食品有限責(zé)任公司，生產(chǎn)日期為2015年6月12日；C5～C30正構(gòu)烷烴混合物（色譜純）：美國(guó)Supelco公司；正己烷（色譜純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：河南省予華儀器有限公司；固相微萃取專用采樣臺(tái)、手動(dòng)進(jìn)樣手柄及DVB/CAR/PDMS萃取頭（50/30 μm，灰色）、7890B氣相色譜-5977A型質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Supelco公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理

先將固相微萃取纖維頭在氣相色譜進(jìn)樣口于250 ℃老化至無雜峰，取4 g樣品放入15 mL的樣品瓶中，放入60 ℃恒水浴鍋里，平衡10 min后，再將纖維頭插入瓶中，頂空吸附40 min后拔出，在溫度250 ℃的GC-MS儀的氣相色譜進(jìn)樣口中解析5 min，進(jìn)行GC-MS分析。

1.3.2 GC-MS條件

氣相色譜（GC）條件：HP-5MS型色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm），升溫程序：起始溫度40 ℃，保持2 min，然后以5℃/min的速度升到200℃，再以15℃/min的速度升到280 ℃，保持2 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃，不分流，載氣為He，載氣流速為1.0 mL/min。

質(zhì)譜（MS）檢測(cè)條件：電離方式為電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿150 ℃，傳輸線溫度230 ℃，全掃描模式，掃描質(zhì)量范圍為25～500 amu，無溶劑延遲。

1.3.3 揮發(fā)性化合物鑒定

定性方法：以美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST）譜庫檢索為主，同時(shí)結(jié)合人工解析質(zhì)譜圖；計(jì)算揮發(fā)性成分的保留指數(shù)，并與文獻(xiàn)值進(jìn)行比對(duì)。選擇匹配度＞75%的化合物。保留指數(shù)（retention index，RI）計(jì)算公式如下[9]：

式中：RI為保留指數(shù)；ti為待測(cè)組分的調(diào)整保留時(shí)間，min；tn為具有n個(gè)碳原子的正構(gòu)烷烴的調(diào)整保留時(shí)間，min；tn+1為具有n+1個(gè)碳原子的正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間，min。

定量方法：采用面積歸一化法，求得各揮發(fā)性成分的相對(duì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取時(shí)間對(duì)揮發(fā)性成分提取效果的影響

選取提取時(shí)間為20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，考察提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，隨著提取時(shí)間的增加，總峰面積和分離出的有效峰個(gè)數(shù)均逐漸增大；提取時(shí)間達(dá)到40 min時(shí)，總峰面積和分離出的有效峰個(gè)數(shù)均達(dá)到較大值，這是由于提取的揮發(fā)性成分大多是易揮發(fā)、低沸點(diǎn)的成分，提取時(shí)間較短時(shí)，吸附提取不完全；隨著提取時(shí)間的增長(zhǎng)，吸附提取逐漸充分完全。提取時(shí)間繼續(xù)增加，分離出的有效峰個(gè)數(shù)和總峰面積均逐漸減小，這是由于提取時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，一方面會(huì)使得易揮發(fā)、低沸點(diǎn)成分的解析增加，另一方面水及一些揮發(fā)性低的成分被萃取出來，使得有效成分?jǐn)?shù)減少；故提取時(shí)間為40 min時(shí)較為適宜。

圖1 提取時(shí)間對(duì)東北特產(chǎn)大醬揮發(fā)性成分提取效果的影響Fig.1 Effect of extraction time on the extraction of volatile compounds from northeast soybean paste

2.2 提取溫度對(duì)揮發(fā)性成分提取效果的影響

提取時(shí)間為40 min，分別選取提取溫度為30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃，考察提取溫度對(duì)大醬中揮發(fā)性成分提取效果的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 提取溫度對(duì)東北特產(chǎn)大醬揮發(fā)性成分提取效果的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction of volatile compounds from northeast soybean paste

由圖2可知，提取溫度逐漸升高，總峰面積和分離出的有效峰個(gè)數(shù)均逐漸增大；溫度達(dá)到60 ℃時(shí)，總峰面積和分離出的有效峰個(gè)數(shù)均達(dá)到較大值；溫度繼續(xù)升高，分離出的有效峰個(gè)數(shù)和總峰面積均有所減小。這是由于提取溫度較低時(shí)，大醬所含成分沒有完全揮發(fā)出來，而溫度過高時(shí)會(huì)使得易揮發(fā)、低沸點(diǎn)成分的解析增加；故提取溫度為60 ℃時(shí)較為適宜。

2.3 揮發(fā)性成分分析

采用固相微萃取法對(duì)東北特產(chǎn)大醬中的揮發(fā)性成分萃取40 min，水浴溫度60 ℃，結(jié)合GC-MS對(duì)得到的揮發(fā)性成分提取物進(jìn)行分析，所得總離子流色譜圖如圖3所示，鑒定出的成分見表1。

圖3 東北特產(chǎn)大醬中揮發(fā)性成分總離子流色譜圖Fig.3 Total ion chromatogram of volatile compounds from northeast soybean paste

表1 東北特產(chǎn)大醬中揮發(fā)性成分的GC-MS分析結(jié)果Table 1 GC-MS analysis results of volatile constituents in northeast soybean paste

續(xù)表

由圖3和表1可以看出，采用較優(yōu)的提取條件來提取東北特產(chǎn)大醬的揮發(fā)性成分，并且經(jīng)GC-MS分析，共鑒定出28種揮發(fā)性成分，相對(duì)含量占總流出物的89.02%，包括酮類3種（53.57%）、酸類3種（13.36%）、醇類2種（13.20%）、酯類8種（3.57%）、酚類2種（2.44%）、醛類5種（1.55%）、其他類5種（1.33%）。其中相對(duì)含量＞1%的成分有：3-乙酰基-6-甲基-2,4-吡喃二酮（53.38%）、乙醇（12.93%）、苯甲酸（7.78%）、乙酸（5.26%）、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚（1.93%）、苯甲酸乙酯（1.48%）。

鑒定出來的揮發(fā)性成分種類中酯類化合物種類較多，其中苯甲酸甲酯具有濃郁的冬青油和卡南迦油香氣；苯甲酸乙酯具有類似依蘭的香氣并微帶果香；棕櫚酸甲酯和棕櫚酸乙酯呈微弱蠟香、果香和奶油香氣[23]；而油酸甲酯、油酸乙酯、亞油酸甲酯和亞油酸乙酯可能是由大豆中所含的油酸及亞油酸衍生而來，呈油脂香氣。這些酯類化合物賦予了東北特產(chǎn)大醬果香、甜香和脂香。

其次是醛類化合物，醛類化合物的閾值較低，對(duì)大醬整體香氣貢獻(xiàn)較大。醛類化合物的形成可能是發(fā)酵過程中放熱引起不飽和脂肪酸脫羧基或碳鏈氧化[24]。苯甲醛具有近似苦杏仁的氣味；苯乙醛有近似風(fēng)信子花香和甜香；（反）-2-辛烯醛呈清新的瓜香、草香及香蕉葉樣脂肪氣息；壬醛和（反）-2-壬烯醛具有青香及瓜果香[23]。這些醛類化合物賦予了大醬堅(jiān)果香、青香和瓜果香。

酮類和醇類化合物雖種類較少，但其相對(duì)含量均較高，分別為53.57%和13.20%，其中揮發(fā)性成分3-乙酰基-6-甲基-2,4-吡喃二酮相對(duì)含量為53.38%，具有焦甜氣息[25]；3-辛酮具有水果微帶薰衣草的氣味[25]；醇類化合物中，1-已烯-3-醇具有蘑菇香氣和草香[25]。酮類和醇類化合物賦予了大醬果香、草香。

酚類化合物中4-乙烯基-2-甲氧基苯酚呈強(qiáng)烈香辛料、丁香和發(fā)酵似香氣，有炒花生氣息[25]；愈創(chuàng)木酚具有煙熏、辛香、藥香、肉香香氣[25]。酸類化合物中，乙酸可能部分是由生產(chǎn)過程中乙醇氧化而成或微生物發(fā)酵而成。而其他類化合物中，2,3,5,6-四甲基吡嗪具有堅(jiān)果香、可可和咖啡的香氣特點(diǎn)[23]。這些化合物賦予了東北特產(chǎn)大醬辛香、醬香、烤香，使大醬整體香氣透發(fā)。

從鑒定出來的物質(zhì)用途來看，有的酚類、酮類、及酯類揮發(fā)性成分具有防腐抗菌、抗氧化等功效。酚類化合物中，愈創(chuàng)木酚及相應(yīng)的衍生物具有一定的抑菌作用；酮類化合物中，3-乙酰基-6-甲基-2,4-吡喃二酮，又名脫氫乙酸，它及其鈉鹽均為常用防腐劑，對(duì)霉菌有較強(qiáng)的抑制作用；酯類化合物中的亞油酸甲酯對(duì)急慢性炎癥有一定的防治作用，而亞油酸乙酯具有降低膽固醇和血脂的作用，可預(yù)防或減輕脈粥樣硬化癥[26]。這些化合物使東北特產(chǎn)大醬保質(zhì)期較長(zhǎng)，且具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

3 結(jié)論

本研究對(duì)固相微萃取法中的提取時(shí)間和提取溫度進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，提取時(shí)間為40 min、提取溫度為60 ℃時(shí)對(duì)東北特產(chǎn)大醬的揮發(fā)性成分提取效果較好。經(jīng)GC-MS分析，從東北特產(chǎn)大醬中共分離鑒定出28種揮發(fā)性成分，相對(duì)含量占總流出物的89.02%；包括酮類、酸類、醇類、酯類、酚類、醛類等，相對(duì)含量＞1%的成分有：3-乙酰基-6-甲基-2,4-吡喃二酮（53.38%）、乙醇（12.93%）、苯甲酸（7.78%）、乙酸（5.26%）、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚（1.93%）、苯甲酸乙酯（1.48%）。

根據(jù)研究相關(guān)醬類揮發(fā)性成分的文獻(xiàn)報(bào)道[24，27-28]和鑒定出的揮發(fā)性成分的香氣特征及其閾值，得出苯乙醛、3-辛酮、2,3,5,6-四甲基吡嗪、愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚等揮發(fā)性成分對(duì)東北特產(chǎn)大醬整體香氣貢獻(xiàn)較大，賦予了東北特產(chǎn)大醬特有的香氣。與相關(guān)文獻(xiàn)[7]相比，此次檢出了對(duì)整體香氣貢獻(xiàn)較大的2,3,5,6-四甲基吡嗪。

醛類化合物賦予了東北特產(chǎn)大醬賦予了大醬堅(jiān)果香、青香和瓜果香，酯類化合物賦予了大醬賦予了東北特產(chǎn)大醬果香、甜香和酯香，酮類和醇類化合物賦予了大醬果香、草香，酚類和其他類化合物賦予了大醬辛香、醬香、烤香，使大醬整體香氣透發(fā)。此外，有的揮發(fā)性成分還具有防腐抑菌、抗氧化、降血脂等作用。

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