可食懸浮式魔芋載體培養蟲草的研究

羅宇霞，康德燦*，陳彩霞，劉 玉，肖亞琪

（西南科技大學 生命科學與工程學院，四川 綿陽 621010）

冬蟲夏草（Ophiocordyceps sinensis）是一種極其珍貴的食、藥用真菌，富含蟲草多糖、蟲草酸、蟲草素、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、生物堿、各種維生素和20多種礦質元素，具有抑菌、降血糖、抗疲勞、抗腫瘤、提高免疫力等很多藥用功效[1-3]。魔芋（Amorphophallus konjac）的主要成分為葡甘聚糖（konjak glucomannan，KGM），是理想的膳食纖維，不含熱量，有飽腹感，具有減肥、改善腸道環境、抗氧化等功能[4]。葡甘聚糖還具有持水增稠、懸浮、膠凝、黏接、成膜等多種獨特的理化性質而使其具有廣泛的應用和開發價值，由魔芋葡甘聚糖、海藻酸鈉和其他潤滑劑、增塑劑等制備的膜材料，可用于控制藥物的釋放[5-6]。天然的冬蟲夏草十分稀少，難以滿足保健和用藥的要求，所以蟲草真菌人工培養顯得尤為必要。作為魔芋提取物羧甲基魔芋膠的氯乙酸醚化改性產物，已被作為載體材料用于納米粒給藥系統的制備[7]。

1932 年，小林義雄等[8]首次在米飯培養基上成功獲得蛹蟲草子座，拉開了米飯培養基栽培蛹蟲草的序幕。張顯科等[9-12]研究學者，先后以大米、小米、玉米、小麥等培養基培養出蛹蟲草子座。人工培養蟲草主要采取人工栽培和液體培養兩種方法[13]，在人工栽培時，根據栽培容器，可分為瓶栽、袋栽及盒栽3種，近幾年來發展運用最多的是盆栽法[14-15]，但固體栽培具有培養周期長、環境條件不易控制、培養基無法給蟲草菌注入新營養的缺陷；而液體發酵培養蟲草又具有污染率高，子實體產量低而不穩，風險大等缺點；導致人工培養蟲草仍未建立完善的生產模式。

本試驗將魔芋精粉經過加水熱溶、加堿改性制成凝膠，經高壓、高溫、膨化處理，在低溫冷凍條件下制成可食懸浮式改性載體。將魔芋載體漂浮于液體培養基上層，在魔芋載體上接種蟲草菌，隨著其菌絲體生長，魔芋載體均勻吸收液體培養基營養，不斷地向蟲草菌提供液體中的營養和魔芋本體中的營養。采用改性魔芋載體培養蟲草能在較短時間生產出蟲草菌絲體，出草成熟后將載體及菌絲體同時收獲，可獲得兼具蟲草、魔芋兩者藥用價值的復合功能型保健材料，極具有開發潛力。本研究為中小保健食品企業開創了一種新型的試驗模型。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

大邑蟲草菌種（Cordyceps dayigensis，CD）、廣東蟲草菌（Cordyceps guangdongensis，CG）、四川蟲草菌株（Cordyceps sichuangensis，CS）：華能生物科技公司。

1.1.2 主要試劑

魔芋精粉（食品級）：四川省農副產品加工技術開發公司成都分公司；食用蔗糖、麥麩、蠶蛹粉：市售；酵母膏：上海乾勁化工科技有限公司；VB1（分析純）：威清南波灣生物技術有限公司；蛋白胨：上海乾勁化工科技有限公司；碳酸鈉、碳酸氫鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂均為分析純：南京化學試劑股份有限公司；聚氨酯海綿：蘇州市天啟聚氨脂制品有限公司。

1.1.3 培養基

固體斜面培養基：麥麩20 g、硫酸鎂0.5 g、蔗糖20 g、磷酸二氫鉀1.5 g、蛋白胨2 g、酵母膏1 g、蠶蛹粉1 g、VB14g，蠶蛹粉1 g，再加入瓊脂粉15 g煮沸，加水定容至1 000 mL，調pH 7.2，分裝18×180 mm試管，120 ℃、0.1 MPa滅菌30 min，放置成斜面冷凝備用。

液體培養基：麥麩20 g、蔗糖20 g、磷酸二氫鉀1.5 g、硫酸鎂0.5 g、蛋白胨2 g、酵母膏1 g、VB14 g。加水定容至1 000 mL，調pH 6.0～6.5，分裝于200 mL三角瓶，120 ℃、0.1 MPa滅菌30 min，備用。

1.2 儀器與設備

JY-1002型電子天平：上海上天精密儀器有限公司；YM100Z智能型立式壓力蒸汽滅菌器：上海嘉措儀器設備有限公司；DHP-9012A電熱恒溫培養箱：上海飛越實驗儀器有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺：蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；BZF-30真空干燥箱：上海科曉科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蟲草菌種的活化

將蟲草菌種接種于固體斜面培養基上，置24 ℃下恒溫黑暗培養7～10 d，讓斜面長滿菌絲。觀察可見菌絲生長濃密旺盛，先呈白色絨毛狀，隨后變成淺桔黃色。

1.3.2 可食懸浮式改性魔芋載體的制備

在高溫（100 ℃）、強堿（pH 12）條件下，魔芋精粉與水比例為1∶35（g∶mL）制作凝膠過程中，葡甘聚糖支鏈上的乙酰基脫離，分子間聯結成立體網狀結構，網眼間保持著不能自由流動的水分，使該物系成具彈性的半固體狀[16-18]，充分體現了葡甘聚糖的賦形性及持水保水性，形成的凝膠經高壓、高溫不能再恢復到流體狀態，由于這種熱不可逆性，可以作為蟲草液體懸浮培養的載體。在脫乙酰反應發生的同時向其中加入碳酸氫鈉（食品級），能使這種葡甘聚糖體內布滿細小均勻的孔徑，將改性制成后的凝膠經過超低溫冷凍、脫水，干燥后形成海綿狀的載體，能平穩漂浮在液體表面，均勻綿延吸收液體中的養分。

（1）魔芋載體制作工藝流程

魔芋精粉→加水→煮沸→加入碳酸鈉→加入碳酸氫鈉→高速攪拌→倒入固形容器→冷凝成型→清水漂洗→沸水焯煮→老化蒸煮→凝膠速凍→解凍→烘干→多孔載體

（2）操作要點：

a.魔芋凝膠初制

當水溫升至50～70 ℃后，取不同魔芋載體配方加入300 mL蒸餾水中，加熱攪動，使之逐漸熟化，與水融為一體。煮沸約30 min魔芋葡甘聚糖充分熟化溶脹后，及時加入碳酸鈉，促使容器內物料加速熟化溶脹，化清，凝固。快速加入碳酸氫鈉，在加入碳酸氫鈉瞬間后，10～15 s內，要快速﹑高速攪拌流質濃料，盡可能多的將空氣攪進物料，以形成氣泡從而增加載體孔徑，使載體能夠很好懸浮。然后要迅速將流質濃料倒入固形容器內，等待物料在室溫下自然冷卻凝固。

用木筷垂直插入檢查凝膠是否已完全成型。如木筷插入后垂立不倒，拔出后留孔不閉合，筷子上不粘膠狀物，說明凝膠已全部成型。用清水漂除余堿。用沸水焯煮除去余堿，再用冷水漂洗，反復2～3次得到多孔魔芋凝膠。

b.魔芋凝膠的老化

先將固定容器內的魔芋糕用80 ℃左右的水溫，蒸煮10～12 min，使產品的韌性和強度增加，含堿量均勻適度。

參考李娟的實驗方法，采用Mixolab混合實驗儀對空白和加酶全麥粉的熱機械學特性參數進行測定。實驗條件選用 Chopin+標準。試驗前，首先需對待測粉樣的水分含量進行測定。整個測試過程獲得的參數（C1、C2、C3、C4、C5、α、β、γ）釋義見文獻[12]。

c.魔芋凝膠的固形

將老化后形狀規則的制品從容器中取出，在沸水中煮5～10 min，形成固定的形狀。

d.魔芋凝膠的冷凍

魔芋凝膠速凍后冰晶粒的增大，使魔芋凝膠變為海棉狀泡沫氣溶膠。冷凍是懸浮載體制作的關鍵工序，分3個階段進行。

第一階段：將固形后的制品，采用冷風、冷水以及自然降溫的方法，使其溫度逐漸降低到常溫以下。

第二階段：將冷卻過的制品，及時迅速轉入冰箱冷藏室，用5 ℃左右的溫度，經15～30 h，進行預凍處理。

第三階段：將預凍制品迅速轉人冷凍室，用-18～-20 ℃的溫度，冷凍至少48～72 h。

e.魔芋凝膠的烘干

將冷凍后的魔芋凝膠烘干，烘干后按照廣口玻璃瓶的大小剪成圓形，逐個稱重、標記、記錄，使用聚氨酯海綿作為對照。在0.1 MPa、121 ℃條件下高壓蒸汽滅菌30 min。將高壓滅菌后的魔芋載體和聚氨酯海綿載體用干燥箱在60 ℃烘干，置真空干燥器中干燥至質量恒定，備用。

1.3.3 魔芋載體綜合評價

選取6名研究人員組成評定小組，進行綜合評分。評分依據有孔徑、浮力、吸水性、柔韌性、成形效果5個方面，按照權重進行綜合評分，孔徑和浮力各占30%，吸水性占20%、柔韌性，成形效果各占10%，滿分為10分。具體評分標準見表1。

表1 魔芋載體的感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standard of Amorphophalms konjac carrier

1.3.4 魔芋載體配方正交優化試驗

查閱大量文獻，在前期單因素試驗的基礎上，篩選魔芋精粉、米粉、碳酸鈉和碳酸氫鈉最佳配方，以魔芋載體綜合評分為評價指標，采用4因素3水平的正交試驗設計，因素與水平見表2。

表2 載體配方優化正交試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal tests for carrier formula optimization

1.3.5 接種與培養

由于魔芋載體和聚氨酯海綿載體都具有孔徑細密、液體吸收力強、浮力好等相似的結構和性狀，本試驗采用聚氨酯海綿載體作為魔芋載體的對照。在超凈工作臺內將魔芋載體和聚氨酯海綿載體放入編號的廣口瓶液體培養基中，液體培養基深約2 cm。將長滿蟲草菌絲的斜面培養基分割成1 cm2見方的小塊，然后分別挑入廣口瓶，置于魔芋載體及海綿載體上。每瓶呈對角線均等放置4塊。接種CS（四川蟲草菌株）、CD（大邑蟲草）、CG（廣東蟲草）菌種，每種蟲草做3個平行，一個對照。

接種完畢后，將已接種的廣口瓶放入恒溫培養箱中24 ℃黑暗培養7 d左右，使菌絲體布滿載體表面，放入培養箱的前3 d要求每天觀察一次，及時清除污染瓶。待菌絲長滿載體表面后，施以200 lx強度的光照，持續培養7～10 d，使菌絲體由白色逐漸轉變為桔黃色，此時應延長光照時間，促使菌絲體轉色、刺激原基形成。蟲草原基形成后繼續培養10 d左右，原基開始分化成子座。

1.3.6 子實體的采收

接種培養兩個月后可見子實體長成上粗下細的棒狀，頂端出現小的突起，且表面出現粒狀粉末時，這表明子實體成熟[19]。子實體成熟后，小心將子實體和載體一起采收。濾去培養液后，放入干凈的培養皿中，置于真空干燥箱內在50 ℃下烘干至恒質量，采用重量法測定其生物量，記錄數據。生物量計算公式如下：

蟲草干質量=載體與子實體烘干物干質量－載體干質量

2 結果與分析

2.1 魔芋載體配方優化正交試驗結果

在單因素試驗基礎上，選擇魔芋精粉（A）、米粉（B）、碳酸鈉（C）和碳酸氫鈉（D）為試驗影響因素，以魔芋載體綜合評分為評價指標，正交試驗結果與分析見表3，方差分析見表4。

表3 載體配方優化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for carrier formula optimization

表4 正交試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal tests results

由表3通過極差R分析可得，各因素對魔芋載體效果影響的主次順序為D＞A＞C＞B，即碳酸氫鈉含量＞魔芋精粉含量＞碳酸鈉含量＞米粉含量。制作懸浮式魔芋載體的最佳配方組合為A2B2C3D3，即魔芋精粉2.0%、米粉2.5%、碳酸鈉0.5%、碳酸氫鈉0.5%。在此最佳載體配方條件下進行驗證試驗，載體綜合評價為9.6分。此配方制作的載體浮力很好，能平穩的漂浮在水面上；質地軟硬強度適中；柔韌性好不易變形；載體內有均勻的細小海綿狀孔徑且孔隙大小均衡；經過干燥后吸水效果好能綿延吸收水溶性營養。

由表4可知，A、B、D因素對綜合評分的作用影響顯著，C因素對綜合評分的作用影響不顯著。因此在篩選魔芋載體配方時要注意調節碳酸氫鈉、魔芋精粉以及米粉的含量。

2.2 生物量測定及分析

待蟲草子實體長成上粗下細的棒狀，頂端出現小的突起，且表面出現粒狀粉末時表明子實體已經成熟，小心將蟲草子實體和載體一起采收。濾去培養液后，放入干凈的培養皿中，在50 ℃條件下置于真空干燥箱內烘干至恒質量，計算其生物量，結果見表5，兩種載體蟲草生物量比較結果見圖1。

表5 蟲草生物量測定結果Table 5 Determination results of Ophiocordyceps sinensis biomass

圖1 蟲草干物質量的測定結果Fig.1 Determination results of dry Ophiocordyceps sinensis biomass

圖1結果表明，在3個蟲草品種中，海綿載體與魔芋載體的蟲草干質量呈現極顯著（P＜0.01）的差異，魔芋載體的四川蟲草與廣東蟲草之間差異不顯著（P＞0.05），而大邑蟲草與四川蟲草和廣東蟲草之間差異顯著（P＜0.05）。這說明使用魔芋載體培養蟲草的生物量明顯高于海綿載體，魔芋載體更適合培養蟲草。

3 結論

天然的冬蟲夏草十分稀缺，難以滿足食用和藥用需求，人工栽培顯得尤為重要。本試驗利用正交試驗優化了懸浮式魔芋載體的制作配方。結果表明，影響魔芋載體性能的主要因素是碳酸氫鈉含量和魔芋精粉含量，其次是碳酸鈉含量，影響最小的是米粉含量。制作魔芋載體的最佳配方為魔芋精粉2.0%、米粉2.5%、碳酸鈉0.5%、碳酸氫鈉0.5%。試驗所設計的改性魔芋葡甘聚糖載體懸浮性和內在孔徑等性能都相當好，能懸浮在液體培養基表面，不必再采用機械支架支撐，實現真正的載體懸浮培養，達到了試驗目的。

通過與海綿載體的對比，結果顯示，懸浮式魔芋載體培養的蟲草菌生物量明顯高于海綿載體，且與傳統的人工栽培蟲草相比，具有生產周期短、設備簡單、投入成本低、見效快、綠色天然等優點。本試驗為產業化生產蟲草藥療保健品，開發中國的藥食資源，探索了一條可行途徑。但如何保持蟲草的優良遺傳性狀，將模型擴大成塑料盒式栽培，采用工業化的生產模式擴大懸浮式載體，進一步增加蟲草菌體的產量，還有待進一步探索。

[1]王玉華，葉 加，李長齡，等.冬蟲夏草提取物延緩衰老實驗研究[J].中國中藥雜志，2004，29（8）：773-776.

[2]姜微哲，渠 凱，朱海波.冬蟲夏草提取物調血脂與抗氧化活性[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（12）：127-131.

[3]羅園香，盛嘉俊，葉克難.一株冬蟲夏草菌的液態發酵條件研究[J].中國釀造，2015，34（4）：78-81.

[4]徐小青，秦清娟，吳 雨，等.羧甲基魔芋葡甘聚糖理化性質及對腸道發酵環境的影響[J].食品科學，2015，36（7）：172-176.

[5]張 瑜，侯世祥.羧甲基魔芋膠凝膠化性能的評價[J].河南大學學報：醫學版，2009，28（3）：163-167.

[6]林慶華，馮麗霞，黃天文.魔芋的藥用價值及應用態勢[J].實用中醫內科雜志，2003，3（4）：259.

[7]DU J,SUN R,ZHANG S H,et al.Novel polyelectrolyte carboxymethyl konjacglucomannan-chitosan.anoparticles for drug delivery[J].Macromol Rapid Comimun,2004,25(2):954-958.

[8]小林義雄，清水大典.冬蟲夏草菌圖譜[M].大阪：保育社，1983.

[9]張顯科，劉文霞.不同培養料栽培蛹蟲草試驗研究[J].中國食用菌，1997，15（2）：21-22.

[10]李 琇.人工培養蛹蟲草[J].微生物學雜志，2002，22（6）：56-57.

[11]馮景剛，劉 影.不同培養基配方培養北蟲草試驗[J].食用菌，2008，30（6）：27-28.

[12]郭俊秀，阿克塔，宋寶香，等.不同培養基主料對北蟲草生長的影響[J].中國園藝文摘，2015，30（4）：75-81.

[13]曲鴻雁，郭成金.冬蟲夏草與蛹蟲草融合子菌絲體液體培養基篩選[J].中國釀造，2013，32（3）：106-109.

[14]劉淑琴，宮文超，李鳳新.北蟲草的三種栽培容器比較[J].食用菌，2011，30（6）：53-62.

[15]薛變麗，劉勇男，楊 杰，等.工廠化栽培北蟲草培養基的優化[J].食用菌，2013，31（6）：29-31.

[16]孫建清，楊莉莉，熊 柏.可逆性魔芋葡甘聚糖凝膠的制備工藝[J].華中農業大學學報，2008，27（2）：321-325.

[17]向 東，賴鳳英，黃立新.改性魔芋甘露聚糖的應用研究進展[J].廣西輕工業，2003，19（1）：5-7.

[18]呂紅英，宋秀文.堿對魔芋凝膠物性的影響[J].吉林農業科技學院學報，2006，15（3）：5-8.

[19]宋仙妹，常繼東.蛹蟲草菌絲體培養特性的研究[J].食用菌，2008，27（3）：12-14.