桑葚果醋發酵條件的優化

徐 佳，高 萌

（江西中醫藥大學，江西 南昌 330004）

桑葚（Fructus mori）是桑科桑屬植物成熟果穗的統稱（又名桑果），營養價值很高，既可食用又可入藥，且汁濃似蜜，香甜可口，被譽為“民間圣果”[1]。桑葚果實中含有1.17%的蛋白質、2.15%的脂肪、4.4%的糖類、6.6%的可溶性固形物、0.47%的礦物質、0.56%的有機酸。此外，還富含維生素（如VC、VB1、VB2）及胡蘿卜素等[2]。我國傳統醫學認為，桑葚能補益肝腎、黑發明目、養血生津[3]。鑒于桑葚的諸多營養保健功能，被衛生部正式列為首批“既是食品又是藥品”的名單[1]。

與糧食醋相比，果醋富含有機酸和維生素，其營養保健功能和口感更佳。桑葚果醋以新鮮壓榨的桑葚果汁為主要原料，經微生物發酵而成，不僅包含一般食醋的保健功能，而且具有桑葚的生理功能，如解除疲勞，消除肌肉疼痛，降低血壓，分解血膽固醇，預防動脈硬化和心血管病的發生，增加食欲，促進消化，保護皮膚等作用[4]。隨著我國消費者營養保健意識的日益增強，對營養保健品的需求也越來越高，桑葚加工成的食品目前卻未很好地被開發利用[5]，然而它所具有較高的醫療保健功能，必定能在國內市場上受到廣大消費者的青睞[6]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

桑葚：市購。

1.1.2 菌種

醋酸菌A32：江西農業大學實驗基地；安琪釀酒高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司。

1.1.3 培養基

酒精發酵基本培養基：將處理好的桑葚汁用蔗糖調整至所需糖度，用0.1 mol/L檸檬酸調其pH值至4，于250 mL三角瓶分裝100 mL，80 ℃滅菌10 min[7]。

醋酸發酵基礎培養基：1%葡萄糖，1%酵母膏，調pH值至5.5，121 ℃滅菌15 min冷卻至70 ℃后移加4%vol的無水乙醇[8]。

1.2 儀器與設備

YXQ-SG46-280S全自動高壓滅菌鍋：上海博迅實業有限公司；XHZ-30臺式恒溫搖床：上海堪鑫儀器設備有限公司；LRH-70生化培養箱：上海合恒儀器設備有限公司；WW163附溫糖度計：深圳博大精科實業有限公司；LWGY酒精濃度計：廣州銘睿電子科技有限公司；HH-6雙浴六孔恒溫水浴鍋：上海喬躍電子有限公司；CPA6202S電子天平：德國塞多利斯公司。

1.3 方法

1.3.1 桑葚果醋加工工藝流程[9]

1.3.2 酒精發酵試驗

在酒精發酵基本培養基中加入酵母菌，參照文獻[10-11]，研究酵母接種量（5%、10%、15%、20%、25%）、發酵溫度（26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃）、糖度（8%、10%、12%、14%、16%）對酒精發酵的影響。并在單因素試驗的基礎上進行正交試驗，正交試驗因素與水平見表1。

表1 桑葚果醋酒精發酵正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for mulberry alcoholic fermentation conditions optimization

1.3.3 醋酸發酵試驗

將活化的醋酸菌A35接入醋酸菌液體種子培養基中，于30 ℃、150 r/min的條件下搖床培養2 d，得到醋酸菌種子液，分別研究初始酒精度（2%vol、4%vol、6%vol、8%vol、10%vol）、醋酸菌接種量（4%、8%、12%、16%、20%）、發酵溫度（26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃）3個因素對桑葚果醋發酵的影響，并在單因素試驗的基礎上確定以下正交因素與水平，見表2。

表2 桑葚果醋醋酸發酵正交試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal tests for mulberry acetic acid fermentation conditions optimization

1.3.4 測定方法

酒精度測定[12]：蒸餾法；糖度測定：糖度計法[12]；產酸量（以醋酸計）測定[13]：酸堿滴定法。

2 結果與分析

2.1 桑葚果汁酒精發酵試驗

2.1.1 酵母接種量對酒精發酵的影響

在酒精發酵基本培養基中加入蔗糖調節糖度至10%，分別接種5%、10%、15%、20%、25%的酵母液，每個接種量設3個平行試驗，于30 ℃的恒溫培養箱中發酵4 d后取樣測定酒精度，結果見表3。

表3 酵母菌接種量對酒精度的影響Table 3 Effect of yeast inoculum on alcohol content

由表3可知，酒精度隨著酵母接種量的增加呈增長趨勢，當酵母接種量為15%時酒精度最高，為6.1%vol。隨著接種量的進一步增加，酒精度反而降低，因此，過高的酵母接種量可能會導致培養基營養的大量消耗而影響酒精發酵。因此，酵母接種量15%為宜。

2.1.2 發酵溫度對酒精發酵的影響

在酒精發酵基本培養基中加入蔗糖調節糖度至10%，接種15%的酵母液，分別置于26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃恒溫培養箱中發酵，每個溫度設置3個平行試驗，培養4 d后取樣測定酒精度，結果見表4。

表4 發酵溫度對酒精度的影響Table 4 Effect of fermentation temperature on alcohol content

由表4可知，溫度達30 ℃時酒精度最高，為5.8%vol，因此，溫度為30 ℃桑葚果汁酒精發酵最佳。

2.1.3 糖度對桑葚果汁酒精發酵的影響

在酒精發酵基本培養基中接入15%的酵母液，用蔗糖分別調整糖度為8%、10%、12%、14%、16%，每個糖度設置3個平行試驗，于30 ℃恒溫培養箱中發酵，培養4 d后取樣測定酒精度，結果見表5。

表5 糖度對酒精發酵的影響Table 5 Effect of different sugar content on alcohol content

由表5可知，酒精度隨著糖度的增加呈增長趨勢，當糖度達到14%時酒精度最高為6.5%vol。隨著糖度的進一步增加，酒精度反而降低，糖濃度過高反而會對酒精發酵產生抑制作用。因此，糖度14%為宜。

2.1.4 桑葚果汁酒精發酵的正交試驗

為了確定桑葚果汁酒精發酵的最佳工藝條件，在單因素試驗的基礎上，采用L9（33）正交試驗，考察酵母接種量、發酵溫度、糖度3個因素對酒精度的影響，正交試驗結果見表6，方差分析見表7。

由表6可知，各因素對酒精度的影響次序為A（酵母接種量）＞C（糖度）＞B（溫度）；酒精發酵的理論最佳組合為A2B2C3，即酵母接種量15%，溫度30 ℃，糖度16%，在此條件下酒精度為6.3%vol。由表7可知，酵母接種量對試驗有顯著影響（P＜0.05）。

表6 桑葚果醋酒精發酵正交試驗結果與分析Table 6 Results and analysis of orthogonal tests for mulberry alcoholic fermentation conditions optimization

表7 桑葚果醋酒精發酵正交試驗的方差分析Table 7 Variance analysis of orthogonal tests for mulberry alcoholic fermentation conditions optimization

2.2 桑葚果醋發酵試驗

2.2.1 初始酒精度對桑葚果醋發酵的影響

在醋酸發酵基礎培養基中加入95%無水乙醇用以調整酒精度至2%vol、4%vol、6%vol、8%vol、10%vol和6%種子液，分別于120 r/min、30 ℃恒溫搖床培養，每個濃度設置3個平行試驗。每隔1 d取樣測定酸度，計算產酸量，結果見圖1。

圖1 初始酒精度對產酸量的影響Fig.1 Effect of initial alcohol concentration on acid production

從圖1可以看出，初始酒精度為4%vol～8%vol時，醋酸菌種發酵旺盛，醋酸產量高，在第5天達到最大值；隨著酒精含量升高，產酸量反而降低。由此可以確定醋酸發酵的最適酒精度為4%vol～8%vol。

2.2.2 醋酸菌接種量對桑葚果醋發酵的影響

在醋酸發酵基礎培養基中分別接入4%、8%、12%、16%、20%的醋酸菌種子液，用95%vol乙醇調節酒精度至8%vol，分別于120 r/min、30 ℃恒溫搖床培養，每個接種量設置3個平行試驗。每隔1 d取樣測定酸度，計算產酸量，結果見圖2。

圖2 接種量對產酸量的影響Fig.2 Effect of acetic acid bacteria inoculum on acid production

從圖2可以看出，接種量為16%時，產酸量在第5天達到最高值。

2.2.3 不同溫度對桑葚果醋發酵的影響

在醋酸發酵基礎培養基中接入16%的醋酸菌種子液，用95%vol乙醇調節酒精度至6%vol，分別放置溫度26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃，120 r/min的恒溫搖床上培養，每個溫度設置3個平行試驗。每隔1 d取樣測定酸度，計算產酸量，結果見圖3。

圖3 溫度對產酸量的影響Fig.3 Effect of temperature on acid production

從圖3可以看出，發酵溫度為30～34 ℃時，醋酸菌種發酵旺盛，醋酸產量高，在第5天達到最大值；由此可以確定發酵醪的最適溫度為30～34 ℃。

2.2.4 桑葚果醋發酵的正交試驗

為了確定桑葚果醋發酵的最佳工藝條件，在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗L9（34），考察醋酸菌接種量、發酵溫度、初始酒精濃度3個因素對醋酸發酵的影響，正交試驗結果見表8，方差分析結果見表9。

表8 桑葚果醋醋酸發酵正交試驗結果與分析Table 8 Results and analysis of orthogonal tests for mulberry acetic acid fermentation conditions optimization

表9 桑葚果醋酸發酵正交試驗的方差分析Table 9 Variance analysis of orthogonal tests for mulberry acetic acid fermentation conditions optimization

由表8可知，各因素對醋酸發酵的影響次序為A（酵母菌接種量）＞B（溫度）＞C（初始酒精度），醋酸發酵的最佳組合為A3B2C3：醋酸菌接種量20%，初始酒精度8%vol，發酵溫度32 ℃。在此條件下進行驗證試驗，產酸量達為51.34 g/L。由表9可知，3個因素均對試驗結果無顯著影響。

2.3 成品質量指標

根據以上試驗確定的醋酸發酵的最佳組合，在醋酸發酵基礎培養基中接入20%的醋酸菌種子液，用95%vol乙醇調節酒精度至8%vol，120 r/min，32 ℃恒溫搖床上培養，5 d后，測定其產酸量達51.34 g/L，并觀察其感官指標，測定其理化及微生物指標。

2.3.1 感官指標

色澤：紫紅色，有光澤。香氣：具有醋香和桑葚特有的果香。滋味：無不良異味，酸中微甜。體態：基本澄清，無沉淀。

2.3.2 理化指標

可溶性無鹽固形物≥0.50 g/100 mL；酸（以醋酸計）≥3.5 g/100 mL；砷（以As 計）≤0.5 mg/kg；鉛（以Pb 計）≤1.0 mg/kg；銅（以Cu 計）≤10.0 mg/kg；氨基酸態氮（甲醛法）：0.18 g/100 mL[14]。

2.3.3 微生物指標

細菌總數≤100個/mL；大腸桿菌≤3 MPN/100 mL；致病菌：不得檢出[15]。

3 結論

本試驗采用搖瓶液態發酵法，通過桑葚汁的酒精發酵和醋酸發酵兩個階段的研究，確定了桑葚果醋發酵的最優條件。結果表明，桑葚果汁酒精發酵的最佳工藝參數為溫度30 ℃、糖度16%、酵母菌接種量20%，發酵周期4 d，在此條件下酒精度為6.3%vol；桑葚果醋發酵最佳工藝參數為溫度32 ℃、酒精度8%vol、醋酸接種量20%，在此條件下產酸量達為5.13 g/L。

[1]金 杰，李志西，張 鋒，等.桑葚醋提取物抗氧化性的研究[J].中國釀造，2005，24（10）：20-22.

[2]史清龍，樊明濤，馬兆瑞.營養型桑葚酒加工工藝的研究[J].釀酒，2005，32（6）：78-79.

[3]徐輝艷，濮智穎，王漢屏，等.桑葚果醋發酵工藝條件的研究[J].食品工業科技，2009，30（2）：164-165.

[4]魏宗萍，李志西，于修燭，等.桑葚醋減肥作用的動物實驗研究[J].中國釀造，2005，24（12）：5-7.

[5]馬錦軍，周象海，王照紅，等.桑葚深加工研究進展[J].廣西蠶業，2013，50（3）：50-54.

[6]王鴻飛，李和生，韓素珍，等.桑葚的加工利用[J].寧波大學學報，1999（12）：81-84.

[7]張慶華，孔令保，朱向東，等.蘋果醋發酵條件的優化研究[J].安徽農業科學，2009，37（32）：15974-15976，15983.

[8]徐 佳，占詩艷.醋酸菌發酵條件優化的研究[J].安徽農業科學，2014，42（6）：1792-1794.

[9]鄭瑞婷，劉長海，蔡素華.蘋果醋釀造工藝研究[J].廣東農業科學，2010（6）：140-142.

[10]韓翠萍，張秀玲，將國龍.蘋果醋加工工藝的研究[J].北方園藝，2003（4）：78-79.

[11]瞿瑋瑋，顧立眾.蘋果醋疊式動態表面發酵技術研究[J].食品科技，2004，29（7）：67-69.

[12]顧小清，高偉娜.液態深層發酵蘋果醋關鍵技術的研究[J].中國釀造，2007，26（10）：67-70.

[13]張永鳳，盧紅梅.優良醋酸菌的分離純化[J].食品研究與開發，2007（10）：89-91.

[14]南 亞.桑葚保健果醋工藝研究[J].食品科技，2008，33（3）：82-84.

[15]劉玉靜.桑葚營養保健飲料的研制[J].糧油加工與食品機械，2004（3）：64-67.