高效液相色譜-熒光檢測法檢測大米中的赭曲霉毒素A

梁桂娟，張 瓊，楊 波

（貴州省產品質量監督檢驗院，貴州 貴陽 550004）

我國大多數人以大米為主食，但由于近些年來優質米的產量和銷量受到影響，導致一些糧食經營企業收購的大米大量囤積。糧食在收獲時未被充分干燥或貯藏運輸過程中濕度和溫度高都會加速糧食上的真菌迅速生長[1-2]。真菌毒素是真菌在食品或飼料里生長所產生的代謝產物，對人類和動物具有危害。赭曲霉毒素是由曲霉屬和青霉屬產生的一組重要的、污染食品的真菌毒素，其中赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）的毒性最強[3]，它能對肝、免疫系統、腎等產生損害[4]，甚至有致畸和突變作用[5]，被世界衛生組織的國際癌癥研究組織列為2B級疑致癌物質[6]。GB 2761—2011《食品安全國家標準食品中真菌毒素限量》中規定谷物及其制品中赭曲霉毒素A的限量為5.0 μg/kg[7]。

目前報道的用于檢測赭曲霉毒素A的方法很多，主要有薄層層析法[8]，酶聯免疫吸附法[9]，膠體金免疫層析分析法[10]，液相色譜-質譜聯用法[11-12]，高效液相色譜-熒光檢測法[13]等。薄層層析法為定性或半定量的方法，檢測周期長，靈敏度和重現性差。酶聯免疫法較為常用，且靈敏度高、簡單快速，但檢測時假陽性率較高。膠體金免疫層析技術是一種快速測定的方法，但適合于保鮮時間短、檢測量大的產品。超高效液相色譜-串聯質譜法省時高效，但成本高。而高效液相色譜-熒光檢測技術靈敏度高，結果準確，而且可以用于同時檢測多種真菌毒素[14]。因此，本實驗利用高效液相色譜-熒光檢測技術分析檢測大米中的赭曲霉毒素A，為糧食中赭曲霉毒素A的檢測和調查提供良好的技術手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米：市售。赭曲霉毒素A標準品（純度＞99%）：北京泰樂祺科技有限公司。

0.22 μm有機濾膜：上海澤孚實業有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）：天津市津東天正精細化學試劑廠；氯化鈉、碳酸氫鈉等試劑為國產分析純。

磷酸鹽緩沖溶液：取8.0 g氯化鈉，1.2 g磷酸氫二鈉，0.2 g磷酸二氫鉀，0.2 g氯化鉀溶于990 mL水中，用濃鹽酸調pH至7.0，再用水稀釋至1 L。

淋洗緩沖溶液：取25 g氯化鈉，5 g碳酸氫鈉溶于水中，加入0.1 mL吐溫-20，用水稀釋至1 L。

1.2 儀器與設備

YP202N型電子天平（感量0.01 g）：上海精密科學儀器有限公司；EE2101粉碎機：普潤有限公司；Agilent1260高效液相色譜儀（帶熒光檢測器）：安捷倫科技有限公司；Bag-Mixer 400SW均質器：法國interscience有限公司；Mnltireax振蕩混勻器：德國Heielolph公司；Allegra X-22R冷凍離心機：美國貝克曼庫爾特公司；TurboVap氮吹儀：美國Biotage公司；PriboFast 赭曲霉毒素免疫親和柱（25T）：北京泰樂祺科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱為Agilent C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：25 ℃；流動相：乙腈-水（1%甲酸）=45∶55；流速∶1.0 mL/min；進樣量：10 μL；熒光檢測波長：激發波長333 nm，發射波長460 nm。

1.3.2 樣品前處理

提取：取粉碎的樣品25.0 g（精確至0.01 g），加2.5 g氯化鈉和50 mL提取液，劇烈振蕩提取10 min，靜置，過濾，取5 mL濾液轉入25 mL比色皿中，用磷酸鹽緩沖液定容至刻度，混勻并過濾。

凈化：將上述濾液全部倒入玻璃注射器中，下接赭曲霉素免疫親和柱，以不超過1 mL/min的流速過柱。待流干后依次用10 mL淋洗緩沖液和10 mL水淋洗免疫親和柱，棄去，再用5.0 mL甲醇以上述方式洗脫，收集洗脫液，于45 ℃氮氣吹干，用流動相定容至1 mL，過0.22 μm有機濾膜，上機分析測定。

1.3.3 標準曲線的繪制

準確稱取適量（精確至小數點后四位）赭曲霉素A標準品，用少量甲醇溶解并定容，配制成質量濃度為0.1 mg/mL的赭曲霉素A標準儲備液。準確移取適量赭曲霉素A標準儲備液，用甲醇稀釋成質量濃度為2 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L的系列標準使用液。以峰面積（y）為縱坐標，赭曲霉毒素A含量（x）為橫坐標進行線性回歸，得標準曲線。

1.3.4 赭曲霉毒素A含量計算

試樣中赭曲霉毒素A含量的計算公式如下[15]：

式中：X為試樣中赭曲霉毒素A的含量，μg/kg；c為試樣提取凈化液中赭曲霉毒素A的含量，μg/L；V為甲醇洗脫液體積，mL；m為試樣質量，g；d為樣品稀釋比。

2 結果與分析

2.1 標準品及樣品溶液色譜圖的繪制

根據1.3的色譜操作條件，得到標準品和樣品中的OTA色譜圖見圖1。由圖1可知，所得OTA色譜峰形對稱，基線平穩，且樣品中的OTA和雜質的分離度好。

圖1 標準品(A)和樣品加標(B)的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC of standard (A) and sample (B)

2.2 標準曲線的繪制

由圖2可知，線性回歸方程為y=0.05x+0.005，相關系數R2=0.999 16，結果表明，在0～200 ng/mL范圍內二者線性關系良好。

圖2 赭曲霉毒素A標準曲線Fig.2 Standard curve of ochratoxin A

將標準品使用溶液逐級稀釋，以信噪比S/N=3時的質量濃度為能檢測的最低質量濃度，根據本方法中樣品的取樣量和定容體積，測得赭曲霉毒素A的檢出限為0.8 μg/kg。

2.3 回收率實驗

精密稱取樣品25.00 g，分別按照添加量為1.0 μg/kg、2.0 μg/kg、5.0 μg/kg加入赭曲霉毒素A標準品，之后按1.3.2的前處理方法和1.3.1的色譜條件進行測定，每個水平平行測定3次，測定其回收率及相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），結果見表1。

表1 樣品回收率實驗結果Table 1 Results of recovery assay

由表1可知，檢測結果所得平均回收率為77.7%～81.1%，平均RSD為2.1%～3.1%，表示該方法準確度高。

2.4 精密度實驗

為進一步考察整個過程的一致性，對10 μg/L的赭曲霉素A標準品連續進樣6次，每次進樣10 μL，根據峰面積計算精密度及RSD，結果見表2。

表2 精密度實驗結果Table 2 Results of precision assay

由表2可知，檢測結果的平均RSD為0.71%，＜5%，表示該方法精密度良好。

2.5 重現性實驗

精確吸取來自同一批原料的試樣，按上述測定方法平行測定6次，檢驗方法的重現性，結果見表3。

表3 重現性實驗結果Table 3 Results of reproducibility assay

由表3可知，RSD=2.0%，＜5%，表明該方法重現性好，方法穩定。

2.6 樣品中赭曲霉毒素A含量的測定

抽檢市面上不同來源的大米共38份，按1.3.1和1.3.2的儀器條件和前處理方法進行上機測定，結果發現有5份樣品含有OTA，其余均為未檢出，檢出率為13.2%，測得其含量分別為1.23 μg/kg、1.58 μg/kg、4.15 μg/kg、2.05 μg/kg、2.13 μg/kg，均小于國家標準規定的限量值（5 μg/kg）。這可能是由于不同樣品大米的產地、儲藏時間、儲藏環境都有所不同所導致。

3 結論

建立了高效液相色譜-熒光光度法檢測大米中的赭曲霉毒素A含量的方法。結果表明，本方法前處理簡單，準確度和精密度高，檢出限低，加標回收率＞70%，相對標準偏差＜5%，滿足食品檢測的相關法規標準要求，能滿足對樣品快速準確的檢測。

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