酶聯免疫法與液相色譜-串聯質譜法檢測豬肉中沙丁胺醇

何方洋，于信念，王 坤，王兆芹

（1.北京勤邦生物技術有限公司，北京 102206；2.北京市食品安全免疫快速檢測工程技術研究中心，北京 102206；3.金元證券股份有限公司，廣東 深圳 518048）

沙丁胺醇是一種β-受體興奮劑藥物，常用于支氣管哮喘以及哮喘性支氣管炎等呼吸系統疾病的治療[1]。由于沙丁胺醇能夠減少動物的脂肪沉積、提高其瘦肉率、促進動物生長，因此被不良養殖者非法使用。如果食物中殘留沙丁胺醇，那么可導致人體心悸、發燒、頭痛、惡心、戰栗等癥狀，對消費者的身體造成傷害[2-3]，因此，各國政府都嚴禁沙丁胺醇用作飼料添加劑，我國農業部發布的《食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單》明確規定沙丁胺醇等β-受體興奮劑被禁止所有用途，禁用所有食品動物[4]。

目前，對于沙丁胺醇的殘留檢測主要有高效液相色譜（high performance liquid chromatograph，HPLC）法、液相色譜-質譜（liquid chromatography-mass spectrum，LC-MS）聯用分析法[5-6]、氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法[7-9]、毛細管區帶電泳法（capillary zone electrophoresis，CZE）[10-12]、酶聯免疫測定（enzymelinked immunosorbent assays，ELISA）法[13-15]、膠體金免疫層析方法（colloidal gold immunochromatographic assay，GICA）等檢測方法[16-18]，儀器檢測方法具有檢測精確度高的優點，但其儀器化程度高，樣品處理較復雜、檢測費用高，難以對樣品進行大量測定，而酶聯免疫檢測方法對實驗人員要求較低，操作簡單、快速，無需大型儀器，特異性也較高，可同時檢測大量樣品，因此本研究采用酶聯免疫檢測方法（ELISA）和液相色譜-串聯質譜（liquid chromatography-tandem spectrometry，LC-MS/MS）法測定豬肉樣品中沙丁胺醇的殘留量，對比分析這兩種方法的檢測限、準確度、精密度，由此評估酶聯免疫法檢測沙丁胺醇的準確性，為快速檢測方法的推廣使用提供基礎研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉：市購。

沙丁胺醇標準品：美國Sigma 公司；沙丁胺醇試劑盒（其中包括包被有沙丁胺醇偶聯抗原的96孔酶標板、6種質量濃度的沙丁胺醇標準品和1瓶高質量濃度標準品、酶標二抗濃縮液、抗體工作液、濃縮洗滌液、樣本稀釋液、底物液A液和B液、終止液）：北京勤邦生物技術有限公司；三氯乙酸、乙酸銨、高氯酸、氫氧化鈉、乙酸乙酯、叔丁基甲醚、甲酸水溶液、氨水甲醇溶液、β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶均為分析純：北京百欣試劑公司。

1.2 儀器與設備

Alliance2695/Quattro液相色譜-串聯質譜儀：美國Waters公司；DSY-Ⅲ氮吹儀：北京金科精華苑科技有限公司；Anke TDL-40B 低速離心機：上海安亭科學儀器有限公司；90-2 磁力攪拌器：上海振榮科學儀器有限公司；微量移液器（單道20～200 μL、100～1 000 μL、多道250 μL）、MK3酶標儀：美國Thermo公司；DHP-600 生化培養箱：天津市中環實驗電爐有限公司；2000SBL 電子天平：美國Setra公司；QL-901 漩渦混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；8010S 勻漿機：上海斯伯明儀器設備有限公司；KS-Ⅱ振蕩器：上海躍進醫療器械廠；DKZ-2 電熱恒溫振蕩水槽：杭州匯爾儀器設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理方法

（1）酶聯免疫法樣品前處理方法

向（2.0±0.05）g豬肉均質樣品中加入3%三氯乙酸2 mL，渦動5 min，4 000 r/min室溫（20～25 ℃/68～77 ℉）條件下離心5 min；取上清液500 μL，加入0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）500 μL，充分混勻（pH值應在7～9），取50 μL用于酶聯免疫法分析。

（2）液相色譜-串聯質譜方法的樣品前處理方法

豬肉樣品按照國標農業部1025號公告—18—2008《動物源性食品中β-受體激動劑殘留檢測液相色譜-串聯質譜法》（檢測限為0.25 μg/kg）中的操作方法進行樣品前處理[19]。

1.3.2 酶聯免疫方法測定沙丁胺醇方法

取出微孔板，向微孔中加入50 μL 沙丁胺醇標準品/處理好的樣品，然后加入抗體工作液：酶標二抗濃縮液（10∶1，V/V）50 μL，混勻，避光環境25 ℃下反應30 min；用洗滌工作液250 μL/孔洗滌微孔板，然后加入50 μL底物液A液，再加入50 μL底物液B液，混勻，避光環境25 ℃下反應15 min。最后加入50 μL終止液，混勻，設定酶標儀于波長450 nm處測量每孔的吸光度值。

1.3.3 ELISA測定沙丁胺醇標準曲線的繪制及樣品沙丁胺醇含量的計算

標準品或樣本的百分吸光率的計算公式如下：

式中：B為標準品溶液或樣品溶液的平均吸光度值；B0為空

白（濃度為0標準溶液）的吸光度值。

以標準品溶液的百分吸光率（y，%）為縱坐標，以沙丁胺醇標準品質量濃度（x，μg/L）的對數為橫坐標繪制標準曲線，將樣品的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的質量濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣品中沙丁胺醇實際殘留量。

1.3.4 液相色譜-串聯質譜測定條件

（1）液相色譜條件

表1 流動相及梯度洗脫條件Table 1 The conditions of mobile phase and gradient elution program

（2）質譜條件

質譜測定條件見表2。

表2 質譜測定條件Table 2 The condition of mass spectrum

1.3.5 液相色譜-串聯質譜法標準曲線的繪制及樣品濃度的計算

取陰性豬肉添加一定質量濃度的沙丁胺醇標準溶液，按上述方法處理，經液相色譜-串聯質譜法分析，得到峰面積。以沙丁胺醇特征離子質量色譜峰面積（y）為縱坐標，以陰性豬肉添加的沙丁胺醇標準品質量濃度（x）為橫坐標，繪制LC-MS/MS標準曲線，并采用外標法定量。將樣品的峰面積代入標準曲線中，從而讀出樣品所對應的質量濃度即為樣品中沙丁胺醇實際殘留量。

1.3.6 準確度和精密度實驗

分別以回收率和變異系數（coefficient of variation，CV）表示準確度和精密度。稱取陰性豬肉2.0 g置于50 mL聚丙烯離心管中，分別添加沙丁胺醇標準品至終質量濃度為1.0 μg/kg、2.0 μg/kg、4.0 μg/kg。然后利用酶聯免疫法和液相色譜-串聯質譜法測定沙丁胺醇殘留量的回收率和變異系數。

2 結果與分析

2.1 ELISA測定沙丁胺醇標準曲線

按照沙丁胺醇標準曲線制作步驟，分別測定沙丁胺醇標準品質量濃度為0、0.1 μg/L、0.3 μg/L、0.9 μg/L、2.7 μg/L、8.1 μg/L的吸光度值，經ELISA分析，利用RIDAWIN數據分析軟件建立標準曲線，結果見圖1。

圖1 沙丁胺醇ELISA測定標準曲線Fig.1 Standard curve of salbutamol determined by ELISA

由圖1可知，標準曲線回歸方程為y=-2.224 8x-0.815 2，相關系數R2=0.992 8，其中半抑制濃度（50%inhibitory concentration，IC50）值為0.366 μg/L，表明二者線性良好。

2.2 LC-MS/MS測定沙丁胺醇標準曲線

圖2 沙丁胺醇LC-MS/MS測定標準曲線Fig.2 Standard curve of salbutamol of LC-MS/MS determined by LC-MS/MS

分別取陰性豬肉樣品添加沙丁胺醇標準品質量濃度為0、0.5 μg/L、1.0 μg/L、2.0 μg/L、5.0 μg/L、10.0 μg/L，按上述方法處理，經液相色譜-串聯質譜法分析，繪制標準曲線見圖2。

由圖2可知，標準曲線回歸方程為y=2 303.89x，相關系數R2=0.997 37，表明二者線性良好。

2.3 準確度和精密度

常用回收率評估方法準確度，用變異系數評估方法精密度，酶聯免疫法和液相色譜-串聯質譜法測定準確度和精密度實驗結果分別見表3和表4。

表3 ELISA方法測定的準確度和精密度實驗結果Table 3 Determination results of accuracy and precision tests by ELISA

表4 LC-MS/MS法測定的準確度和精密度實驗結果Table 4 Determination results of accuracy and precision tests by LC-MS/MS

由 表3、表4 可 知，分 別 添 加1.0 μg/kg、2.0 μg/kg、4.0 μg/kg 3個濃度水平的沙丁胺醇標準品的豬肉樣品，酶聯免疫法的平均加標回收率分別為83.7%、90.2%和90.9%；變異系數為5.4%～10.3%，液相色譜-串聯質譜法的平均加標回收率分別為86.6%、88.6%和93.5%，變異系數為6.0%～8.3%。兩種方法加標回收率在83.7%～93.5%，變異系數＜10.3%，由此得出酶聯免疫法和液相色譜-串聯質譜法的準確度及精密度均較好。

2.4 檢測限

2.4.1 酶聯免疫法

通過標準曲線得到20個空白豬肉樣品的沙丁胺醇質量濃度。利用公式：檢測限=X+3s（X為重復測定空白樣品的平均值，s為重復測定空白樣品的標準差），得到該方法的檢測限為0.5 μg/kg。

2.4.2 液相色譜-串聯質譜法

最低檢測限按照信噪比3∶1 計算，得到該方法的檢測限為0.25 μg/kg。

2.5 ELISA法和LC-MS/MS法檢測實際樣品結果

利用ELISA法檢測70份豬肉樣品，2份疑似陽性豬肉樣品（沙丁胺醇質量濃度＞0.5 μg/kg）被篩選出，用LC-MS/MS法確證這2份疑似陽性豬肉樣品均為陽性，結果見表5，陽性豬肉樣品中沙丁胺醇的液相色譜-串聯質譜多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）色譜圖見圖3。

圖3 陽性豬肉樣品1(A)及樣品2(B)中沙丁胺醇的MRM色譜圖Fig.3 MRM chromatograms of salbutamol in positive pork sample 1(A) and 2(B)

表5 酶聯免疫法和液相色譜-串聯質譜法檢測結果比較Table 5 Determination results of ELISA and LC-MS/MS

由表5可知，酶聯免疫方法和液相色譜-串聯質譜法測定沙丁胺醇殘留量結果基本一致，并且酶聯免疫方法的假陽性率為0，因此，適用于豬肉產品中沙丁胺醇殘留量檢測的快速篩選。

3 結論

目前，酶聯免疫法和液相色譜-串聯質譜法是測定動物組織中沙丁胺醇殘留量時的常用方法。兩者的區別在于：酶聯免疫法能夠對動物源性食品中沙丁胺醇殘留進行快速大量篩選，檢測時間僅為1～2 h，主要作為一種快速篩選手段，在現場監控和基層檢測中廣泛使用。但由于快速篩選方法的國家標準或行業標準很少，因此給檢測結果判定帶來一定困難。而液相色譜-串聯質譜方法更為準確、靈敏，適合對快速檢測方法的結果進行確證。

本研究利用酶聯免疫法和液相色譜-串聯質譜法測定豬肉樣品中沙丁胺醇藥物殘留量，結果表明，1.0～4.0 μg/kg添加豬肉樣品時酶聯免疫法回收率為83.7%～90.9%，變異系數為5.4%～10.3%，檢測限為0.5 μg/kg；液相色譜-串聯質譜法的平均回收率分別為86.6%～93.5%，變異系數為6.0%～8.3%，檢測限為0.25 μg/kg。酶聯免疫法適用于進行豬肉樣品中沙丁胺醇的快速篩選，液相色譜-串聯質譜法適用于陽性樣品的確證和精確定量。

[1]陳新謙，金有豫.新編藥物學（14 版）[M].北京：人民衛生出版社，1999.

[2]劉宣兵，龐玉芳，侯玉澤，等.沙丁胺醇的毒副作用及其殘留檢測[J].上海畜牧獸醫通訊，2008，53（4）：83-85.

[3]栗 艷.“瘦肉精”的危害及防治[J].中國畜牧獸醫文摘，2011，27（4）：175.

[4]中華人民共和國農業部獸醫局.食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單[EB/OL].http://www.moa.gov.cn/sjzz/syj/dongtai/201006/t20100606_1535262.htm，2002-04-09.

[5]DAVID C J,KENARL D,GEORGE D,et al.The analysis of β-agonists by packed-column supercrltical fluid chromatography with ultraviolet and atmospheric pressure chemical ionisation mass spectrometric detection[J].Analysis,1999,124:827-831.

[6]梁曉聰，程國霞，朱參勝.GC/MS 法同時測定動物組織中4 種β-興奮劑殘留量[J].中國衛生檢驗雜志，2008，18（2）：199-210.

[7]孟 娟，邵 兵，吳國華，等.氣相色譜-質譜法同時測定動物性食品中8 種β-興奮劑的殘留量[J].中國衛生檢驗雜志，2005，15（6）：641-643.

[8]SPISSO B F,LOPES C C,MARQUES M A,et al.Determination of β2-agonists in bovine urine comparison of two extraction/clean-up procedures for high-resolution gas chromatography-mass spectrometry analysis[J].J Anal Toxicol,2000,24(2):146-152.

[9]朱 堅，李 波，方曉明，等.氣相色譜-質譜法測定肝、腎和肉中11種β2-受體激動劑殘留量[J].質譜學報，2005，26（3）：129-137.

[10]陳紅青.高效毛細管電泳法用于飼料中鹽酸克侖特羅與沙丁胺醇含量的測定[J].福州大學學報：自然科學版，2003，31（5）：615-617.

[11]段建平，陳紅青，陳 穎，等.毛細管區帶電泳法同時測定飼料中西馬特羅、鹽酸克侖特羅和沙丁胺醇[J].色譜，2005，23（3）：261-263.

[12]顏流水，溫振東，井 晶，等.豬肝中克倫特羅和沙丁胺醇的毛細管電泳-質譜聯用分析[J].分析測試學報，2006，25（6）：43-45.

[13]HOWELLS L,SAUER M,SAYER R,et al.Extraction and clean up of the beta agonist salbutamol from liver and its determination by enzyme immunoassay[J].Anal Chim Acta,1993,275(1-2):275-278.

[14]楊正濤，張乃生，史利軍，等.β-激動劑多組分殘留的沒臉免疫分析法[J].中國農學通報，2008，24（8）：23-24.

[15]王建平，沈建忠.豬肝和豬尿中沙丁胺醇和克倫特羅殘留的酶聯免疫吸附檢測法研究[J].畜牧獸醫學報，2005，36（4）：397-401.

[16]吳巧麗，葉春生.膠體金免疫層析技術快速檢測沙丁胺醇殘留[J].現代食品科技，2012，28（11）：1595-1599.

[17]張亞峰，張會彩，劉聚祥，等.沙丁胺醇膠體金免疫試紙條的研制[J].中國獸醫雜志，2009，45（9）：59-60.

[18]王 森，周亞蓮，盛慧萍，等.瘦肉精三合一膠體金快速檢測板的研制及在畜肉中的應用[J].浙江農業科學，2012（12）：1715-1719.

[19]中國獸醫藥品監察所.農業部1025 號公告—18—2008，動物源性食品中β-受體激動劑殘留檢測液相色譜-串聯質譜法[S].北京：中國標準出版社，2008.