糖化酶發酵生產中溶解氧的研究

畢 靜

（江蘇經貿職業技術學院科技處，江蘇 南京 211168）

21世紀科技與經濟發展的關鍵技術是生物技術，以工業生物催化技術為重點的工業生物技術在其中占有極其重要的地位，而工業生物催化的核心是生物酶的發現和高效生產。糖化酶是生物酶中應用最廣和產量最大的一種酶制劑。糖化酶發酵過程主要是黑曲霉經深層通風培養后菌體生長和代謝產物積累。在菌體生長、代謝產物積累的過程中，發酵液中溶解氧都需控制在一定范圍內，以達到發酵產酶轉化率的最佳水平，以最低的能源消耗達到最大的產出，即高效生產[1-2]。本試驗主要研究在不改變原糖化酶發酵條件的基礎上通過優化無菌空氣中氧的含量達到改變溶解氧的水平對糖化酶發酵的影響。對于采用高產菌株的好氧發酵來說，溶氧濃度是極其重要的參數，發酵時若溶解氧水平低，微生物就處于缺氧狀態，生長、代謝將受到抑制，代謝產物將減少；若溶解氧過飽和，菌體細胞生長、代謝將處于旺盛狀態，但同樣不利于菌體持續產酶，容易造成菌體衰老[3-5]。

在糖化酶常規發酵過程中，發酵接種前定標相對溶解氧水平為100%，接種后溶解氧開始快速下降，8～12 h后，逐步下降至20%～30%，直至發酵結束。影響溶解氧的因素有很多，與發酵過程中的各種參數有關，同時與發酵罐中各種物理、化學和微生物因素的影響有關，但主要集中在氧的溶解和傳遞這兩個方面?？刂迫苎趿客ǔ猛ㄈ爰冄醯姆绞教岣哐醴謮?；控制氧傳遞速率包括發酵溫度、罐壓、通風量、攪拌轉速、發酵液的黏度、表面張力、流動狀態、發酵罐的結構、各部分尺寸的比例、空氣分布器的形式等[6-8]。本研究利用3因素3水平正交試驗法，通過對罐壓、攪拌速度和壓縮空氣中氧濃度這3個對發酵液溶解氧有重大影響作用的因素進行發酵產酶條件優化，以提高糖化酶的發酵酶活，為糖化酶的高效生產提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糖化酶生產用菌為黑曲霉（Aspergillus niger）：實驗室保藏。

乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（pH 4.6）、硫代硫酸鈉標準溶液（0.05 mol/L）、碘溶液（0.1 mol/L）、氫氧化鈉溶液（0.1 mol/L）、200 g/L可溶性氫氧化鈉溶液、硫酸溶液（2 mol/L）、可溶性淀粉溶液（分析純）：江蘇博立公司。發酵培養基：淀粉30%，豆餅粉5%，玉米漿5%，（NH）2SO40.5%，自然pH值。

1.2 儀器與設備

FZ-E型2噸發酵罐：江蘇博立公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵方式

發酵條件：發酵溫度34 ℃，攪拌轉速180 r/min，罐壓0.1 MPa，發酵時間120 h，接種量10%。

種子培養條件：培養溫度32 ℃，攪拌轉速240 r/min，罐壓0.05 MPa，發酵時間48 h。

1.3.2 酶活力的測定方法

吸取發酵液1.00 mL移入250 mL容量瓶中，用乙酸緩沖液定容至刻度，搖勻。通過4層紗布過濾，濾液供測定用。

于甲、乙兩支50 mL比色管中，分別加入可溶性淀粉25mL及緩沖液5mL，搖勻后，于40℃恒溫水浴中預熱5 min。在甲管（樣品）中加入待測酶液2 mL，立刻搖勻，在此溫度條件下準確反應30 min，立刻各加入氫氧化鈉溶液（200 g/L）0.2 mL，搖勻，將兩管取出迅速冷卻，并于乙管（空白）中補加待測酶液2 mL，吸取上述反應液與空白液各5 mL，分別置于碘量瓶中，準確加入碘溶液10 mL，再加氫氧化鈉溶液15 mL，搖勻，密塞，于暗處反應15 min。取出，加硫酸溶液2 mL，立即用硫代硫酸鈉標準溶液滴定，直至藍色剛好消失為其終點。通過計算得出酶活力，計算公式如下：

式中：X為樣品的酶活力，U/mL；A為空白消耗硫代硫酸鈉溶液的體積，mL；B為樣品消耗硫代硫酸鈉溶液的體積，mL；c為硫代硫酸鈉溶液的濃度，mol/L；90.05為與1 mL硫代硫酸鈉標準溶液（1 mol/L）相當的以克表示的葡萄糖的質量；32.2為反應液的總體積，mL；5為吸取反應液的體積，mL；2為吸取酶液2 mL，換算為1 mL；n為稀釋倍數；2為反應30 min，換算成1 h[9-10]。

1.3.3 單因素試驗

（1）罐壓對酶活的影響

在發酵溫度34℃、攪拌轉速為180 r/min、發酵時間120 h，接種量10%、氧濃度為25%的條件下，調節罐壓分別為0.05 MPa、0.10 MPa、0.15 MPa、0.20 MPa進行發酵試驗。

（2）攪拌轉速對酶活的影響

在發酵溫度34 ℃、罐壓為0.10 MPa、發酵時間120 h，接種量10%、氧濃度為25%的條件下，調節攪拌轉速分別為120 r/min、180 r/min、240 r/min、300 r/min進行發酵試驗。

（3）氧濃度對酶活的影響

在發酵溫度34 ℃、攪拌轉速為180 r/min、發酵時間120 h，接種量10%、罐壓為0.10 MPa的條件下，調節氧濃度為21%、23%、25%、27%進行發酵試驗。

1.3.4 正交試驗設計

根據前期的研究，選取罐壓、攪拌速度和壓縮空氣中氧濃度作用為考察因素，酶活力為評價指標進行3因素3水平的正交試驗設計。發酵時間均為120 h，即時取樣測定發酵醪糖化酶活力，正交試驗因素與水平見表1。

表1 操作條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for operation conditions optimization

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 罐壓對酶活的影響

圖1 罐壓對酶活的影響Fig.1 Effect of vessel pressure on enzyme activity

罐壓對酶活的影響見圖1。由圖1可知，罐壓對發酵結果影響不大，隨著罐壓的增加，酶活呈先上升后下降的趨勢，在罐壓0.10 MPa時酶活達到最大。保持一定的罐壓，即可保證發酵水平。究其原因，增加罐壓確能提高溶解氧水平，但同時也增加了其余氣體（如CO2）的濃度，且CO2在水中的溶解度比氧高30倍，在較高的罐壓下，不利于液相中CO2的排除，會影響到菌體的生長、代謝。因此，在實際發酵過程中，盲目增加罐壓而提高通氣量不一定就能提高發酵轉化率，反而會增加空氣過濾器的負擔和增加染菌的可能性。故單因素試驗選擇罐壓為0.10 MPa[11-12]。

2.1.2 攪拌轉速對酶活的影響

攪拌轉速對酶活的影響見圖2。由圖2可知，攪拌轉速對發酵結果影響顯著，隨著攪拌轉速的增加，酶活呈先上升后下降的趨勢，在攪拌轉速為180 r/min時酶活最高，超過180 r/min后，發酵轉化率反而開始下降，因為高轉速的攪拌，產生了很大的剪切力，有可能導致微生物菌種受損，造成菌體生長緩慢和產物的失活，而且攪拌功率過大，將導致系統能耗的增加，造成資源浪費。故單因素試驗中選擇攪拌轉速為180 r/min。

圖2 攪拌轉速對酶活的影響Fig.2 Effect of stirring speed on enzyme activity

2.1.3 氧濃度對酶活的影響

圖3 氧濃度對酶活的影響Fig.3 Effect of oxygen concentration on enzyme activity

氧濃度對酶活的影響見圖3。由圖3可知，酶活隨著氧濃度的升高呈一直上升的趨勢，提高壓縮空氣中氧濃度，增加發酵罐內的氧分壓，可以提高發酵轉化率，即提高了氧傳遞推動力，但并不是氧濃度越高越好，如果在大生產中采用純氧來提高壓縮空氣中氧濃度，增加發酵罐內的氧分壓，將既費事又不經濟，且純氧易引起爆炸，因此采用富氧發生器直接接入管道，產生的氧氣將直接進入壓縮空氣系統，只要調節富氧發生器，就可很好地控制壓縮空氣中的氧濃度，是一條經濟的方法。但如果氧濃度超過27%，將會顯著增加成本，故在正交試驗時采用23%、25%和27%這3個水平。

2.2 正交試驗結果

對罐壓、攪拌速度和壓縮空氣中氧濃度3個因素進行3因素3水平的正交試驗，結果見表2，方差分析見表3。

由表2可知，RB＞RC＞RA，最佳水平的參數為A2B2C3，即罐壓0.10 MPa、攪拌轉速180 r/min和氧濃度27%，此條件下酶活為49 610 U/mL。由表3方差分析可知，攪拌轉速對酶活影響最大，有顯著影響，其次為氧濃度，影響最小的是罐壓[13-15]。

表2 操作條件優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for operation conditions optimization

表3 正交試驗方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment

2.3 驗證試驗

根據最佳水平的參數進行了3批驗證試驗，酶活分別為49 100 U/mL、49 900 U/mL和51 000 U/mL，平均酶活為50 000 U/mL。由此可見，此方法可行，能提高糖化酶的發酵轉化率。

3 結論

本研究利用3因素3水平正交試驗法，通過對罐壓、攪拌速度和壓縮空氣中氧濃度這3個對發酵液溶解氧有重大影響作用的因素進行發酵產酶條件優化，得到糖化酶的最優發酵條件為攪拌轉速180 r/min，罐壓0.1 MPa，無菌空氣為富氧無菌空氣，其氧氣通過富氧發生器產生，含量為27%，在此條件下，糖化酶的酶活可達50 000 U/mL。

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