發酵劑用量對硬質蒙古干酪風味變化的影響

高 鑫，張 亮，李 博

（1.上海工會管理職業學院 健康安全系，上海 201415；2.上海交通大學醫學院，上海 200240）

干酪是乳經適當的乳酸發酵后凝乳并分離出乳清后的乳制品，其組織結構好，營養價值高[1]。近年來，干酪產量一直保持著上升趨勢，2011年世界干酪產量已經超過2 000萬t。受居民飲食習慣、對奶酪的認知情況和消費能力等影響，我國干酪的發展正處于市場培育階段[2-3]。有學者建議，中國應借鑒日本和韓國的經驗，對傳統干酪進行配方和工藝優化，制造適合中國人的干酪食品，如蒙古族干酪，藏族、維吾爾族的奶疙瘩，白族的乳扇等[4]。長期以來，這些傳統干酪基本上是家庭作坊式生產，沒有形成規模以及培育穩定的消費群體，對我國干酪市場發展的影響有限。因此，如何加大干酪產品的生產和市場引導的力度，引導消費，研制適合于國人消費的干酪加工技術迫在眉睫[5]。本試驗探討了一種硬質蒙古干酪制作過程中發酵劑的使用量對干酪風味變化和微生物多樣性的影響，為進一步研制和開發該干酪提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料乳、乳清粉、奶油：光明乳業股份有限公司；干酪發酵劑（嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌）：北京川秀國際：丹麥丹尼斯克（中國）有限公司；美國材料與試驗協會D2887-01 N-烷烴標準樣品：美國Restek公司。

平板計數瓊脂培養基（plate count agar，PCA）：蛋白胨貿易有限公司；凝乳酶10.0 g，牛肉粉5.0 g，酵母粉4.0 g，葡萄糖20.0 g，吐溫80 1.0 mL，K2HPO42.0 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸三銨2.0 g，MgSO40.2 g，MnSO40.05 g，瓊脂粉15.0 g，蒸餾水1 000 mL。

大腸桿菌培養基：胰蛋白胨20 g，3號膽鹽1.5 g，乳糖5 g，K2HPO44 g，KH2PO41.5 g，NaCl 5 g。

金黃色葡萄球菌培養基：胰蛋白胨17 g，大豆蛋白胨3 g，NaCl 100 g，K2HPO42.5 g，葡萄糖2.5 g，丙酮酸鈉10 g。

MRS培養基：蛋白胨10 g，牛肉膏粉8 g，酵母膏粉4 g，葡萄糖20 g，K2HPO42 g，檸檬酸三氨2 g，乙酸鈉·3H2O 5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·4H2O 0.05 g，吐溫-80 1 g。

改良MC培養基：大豆蛋白胨5 g，牛肉膏粉3 g，酵母膏粉3 g，葡萄糖20 g，乳糖20 g，CaCO310 g，瓊脂15 g，中性紅0.05 g。

1.2 儀器與設備

VARIOKLAV高壓蒸汽滅菌鍋：美國賽默飛世爾科技公司；FE20pH計：瑞士梅特勒-托利多公司；HPH2000/4-DH5高速剪切均質機：美國IKA公司；MCO-15AC生化培養箱：日本三洋機電有限公司；7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀：美國Agilent公司；50/30 μm Divinylbenzene/Carboxen/PDMS固相萃取探針：美國Supelco公司；DB-5MS色譜柱：百靈威科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 硬質蒙古干酪的制作

原料乳標準化后進行巴氏殺菌處理，將殺菌后的原料乳溫度降至30 ℃，采用直投式加入發酵劑凍干粉，加入量為0.5 g/L、1.0 g/L和1.5 g/L原料乳。發酵劑通過發酵產酸，當原料乳的pH值降低0.1～0.2時，加入凝乳酶（3 g/100 L原料乳，1%的滅菌食鹽水溶解）凝乳40 min，用干酪切刀切割凝塊大小為1 cm左右，采用自然排乳清法將乳清排出，排除后在凝乳粒中加鹽，加鹽量為30 g/kg凝塊。加鹽后的干酪進行裝模（100 mm×100 mm×50 mm），然后放在壓模機上以10 g/cm2壓力壓20 min，50 g/cm2壓2 h后翻轉，100 g/cm2壓16 h。然后切成大小10 cm×5 cm×5 cm的小塊，放在自封袋中，密封后在8 ℃、相對濕度（relative humidity，RH）85%條件下成熟，此時為0 d。根據發酵劑使用量的不同，記為硬質蒙古干酪A（0.5 g/L）、干酪B（1.0 g/L）和干酪C（1.5 g/L）。每隔60 d（含0 d）取樣一次。

1.3.2 成熟過程中風味變化

根據李博等[6]對干酪風味研究的方法，準確稱取5.00 g干酪樣品放在20mL頂空進樣瓶內，加入5 mL 25%NaH2PO4，蓋好蓋子，在50 ℃的超聲波水浴中平衡30 min，使干酪中的風味化合物充分進入頂空進樣瓶的頂空內。將已經老化好的固相萃取頭插入到頂空進樣瓶的頂空內進行萃取，吸附30 min后，拔出萃取頭，將吸附了分析組分的萃取頭插入到氣相色譜質譜聯用儀（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）進樣器內在250 ℃條件下進行解吸，解析后用GC-MS儀器進行分析。

固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）的條件：

設備：CTC三位一體自動進樣器；萃取頭：50/30 μm Divinylbenzene/Carboxen/PDMS；溫度：120 ℃；時間：加熱25min，萃取15min；振蕩速度：加熱250 r/min，萃取250 r/min；解吸時間：3 min。

色譜分析條件：

色譜柱：DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；柱溫：40 ℃保持10 min，以5 ℃/min升至240 ℃，以20 ℃/min升至280 ℃，保持8 min；進樣溫度：250 ℃；控制模式：恒流，1.0 mL/min；接口溫度：280 ℃；離子源溫度：230 ℃；四級桿溫度：50 ℃；電離方式：電子電離（electron ionization，EI），70 eV；掃描方式：全掃描，20～400 m/z，溶劑延遲3.5 min。

得到完整、數據全面的總離子流色譜圖后進行數據分析，通過工作站數據分析軟件和NIST 2011質譜庫提供的標準質譜圖對照，通過面積歸一化得到每種化合物的峰面積。

1.3.3 成熟過程中微生物多樣性變化（培養基方法）

依照GB 4789.18—2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗—乳與乳制品檢驗》進行[7]。

2 結果與分析

2.1 干酪風味變化

利用SPME-GC-MS分析方法對成熟過程中的干酪A、B、C進行揮發性風味化合物的檢測，結果見表1。

由表1可以看出，干酪A在0 d時，共檢測出28種化合物，其中酯類化合物10種，酸類化合物7種，醇類化合物6種，酮類化合物1種，醛類化合物1種，其他類化合物3種。在含量方面，醇類化合物占到70.76%，酯類化合物次之，占到23.48%。隨著干酪的成熟，揮發性風味化合物的種類逐漸增多，到第180天時，共檢出31種化合物，其中酯類化合物由10種增加至15種，含量增加至44.79%。其中，癸酸甲酯由0 d時的19.94%增加至49.36%（120 d），后降低至38.76%（180 d）。而醇類化合物在180 d時下降至42.05%，大部分用于酯類化合物的產生。因此，在干酪A的成熟過程的揮發性風味化合物中，醇類和酯類一直是主要的風味物質。檢測中所得酯類物質中癸酸甲酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸乙酯含量較高，形成了果味特征，給干酪以淡淡的果味氣息。醇類物質中主要是乙醇和異戊醇，表現出溫和的花香味。值得注意的是，干酪中很多代謝途徑都與乙醇的合成有關，如乳糖代謝途徑通過磷酸戊糖途徑產生乙醇等，在干酪成熟后期乙醇參與乙酯類化合物的形成，造成其含量大幅下降，由0 d時的55.66%下降至180 d時的15.80%。酸類物質以乙酸、辛酸和癸酸為主，主要貢獻了干酪風味中的醋味、辛辣味、酸敗味以及部分奶香味。醛、酮類物質分離檢測出的很少，這是由于它們在干酪成熟過程中屬于過渡態化合物，不會在干酪中進行顯著積累，可以迅速被還原生成伯醇或者被氧化生成相應的酸，所以在干酪成熟過程中分離得到的醛、酮類物質很少[8]。

干酪B在0 d時，共檢測出28種化合物，其中酯類化合物11種，酸類化合物7種，醇類化合物6種，酮類化合物1種，醛類化合物1種，其他類化合物2種。在含量方面，醇類化合物占72.76%，酯類化合物次之，占19.52%。隨著干酪的成熟，揮發性風味化合物的種類逐漸增多，到第180天時，共檢出33種化合物，其中酯類化合物由12種增加至15種，含量增加至47.15%，醇類化合物下降至34.06%。干酪B中的醇類物質和干酪A基本一致，由于干酪B使用的發酵劑量多，所以在0 d時產生的乙醇量要高于干酪A，但與干酪C差別不大。在成熟過程中，干酪B和C中乙醇的消耗量也大于干酪A，使得乙醇含量下降較快。酯類化合物主要是癸酸甲酯和辛酸乙酯，它們的風味特征為果味、奶油味等，

其他酯類化合物表現不明顯，含量較低。酸類化合物中以癸酸、辛酸和乙酸為主，酸的含量都高于A組，主要貢獻了干酪風味中的腐臭味、酸味、奶香味等。醛、酮類化合物分離檢測出的也很少。干酪B成熟過程中風味化合物種類多于干酪A，組分更為豐富。但是，干酪B中各風味化合物含量略低于干酪A，較高的發酵劑使用量可以加快揮發性風味化合物產生速度，造成中間產物的減少，終產物的增加。因此，干酪B風味更加均勻適中，可以形成更好的風味感官。

表1 干酪成熟過程中揮發性風味化合物的相對含量變化Table 1 Relative content changes of volatile compounds from the Mongolian cheese during ripening %

干酪C在0 d時，共檢測出32種化合物，其中酯類化合物14種，酸類化合物7種，醇類化合物6種，酮類化合物1種，醛類化合物1種，其他類化合物3種。在含量方面，醇類化合物占71.39%，酯類化合物次之，占19.23%。到第60天時，酯類化合物增加至15種，含量增加至46.01%，醇類化合物下降至32.47%。干酪C中的醇類、酯類化合物與干酪A、B基本一致。酯類化合物主要是癸酸甲酯和辛酸乙酯，醇類化合物主要是乙醇和異戊醇。酸類化合物中以癸酸、辛酸和乙酸為主，由0 d時的9.11%增加至19.82%，遠大于干酪A和B，使得奶酪明顯產生了酸味為主的風味構成，明顯表現出酸味，影響了干酪的口感。

在硬質蒙古干酪的揮發性風味化合物中，以酸、酯、醇三類化合物為主。酯類是硬質蒙古干酪中最重要的芳香物質，其香味閾值普遍較低（平均值為0.1 mg/kg）。除癸酸甲酯外，乙酯類化合物是最重要的一類，表現出明顯的水果香味[9]，如乙酸乙酯可以提供甜味、果香味；己酸乙酯則可以提供果香味和臘味；癸酸乙酯既有果香味還具有明顯的椰子香味等[10]。醇類物質在硬質蒙古干酪也具有較高的產生量，一是乳糖代謝途徑產生；二是脂肪酶對干酪中的脂肪酸進行降解所產生[11]。一般來講，醇類物質閾值較高，在干酪風味中的貢獻較小，但是醇類可以和酸類物質進一步反應生成酯類，可以間接對干酪風味產生影響[12]。醇類物質在干酪中起到的作用主要是提供植物香味及酸敗味等。酸類也是硬質蒙古干酪的重要風味物質之一，主要有甘油三酯水解為脂肪酸或者是代謝過程中產生的中間代謝產物。短鏈脂肪酸對于形成干酪的風味結構具有重要的作用，如辛酸則可能帶來臘味、皂味、酸敗味及果味；癸酸則貢獻酸敗味[13]。一些長鏈的烷烴和干酪中存在的某些細菌有關，其總量較少，同時烴類化合物的芳香風味閾值較高，其本身不具有風味，對干酪的風味影響可以忽略不計[14]。

2.2 微生物多樣性變化

在硬質蒙古干酪成熟過程中，檢測到的微生物除了腸桿菌外，其余微生物都隨時間而增長。從表2可以看出，對于嗜溫好氧菌（total mesophilic aerobic bacteria，TMAB）來講，干酪A、B、C三者都是呈現增長趨勢。

表2 硬質蒙古干酪在成熟過程中的微生物數目變化Table 2 Microbial counts change of Mongolian cheese during ripening lgCFU/g

在干酪制作過程中，使用的發酵劑為嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌，所以乳酸菌是干酪成熟過程中的優勢菌，在干酪成熟早期，在培養基上，兩種乳酸菌數目相差較小，成熟過程中呈現快速增加。但到中后期，嗜熱鏈球菌生長速度趨緩，保加利亞乳桿菌生長速度相對加快。嗜熱鏈球菌的生長與干酪中的鹽分有關，高鹽分會抑制嗜熱鏈球菌的生長速度[15]。保加利亞乳桿菌耐受力相對較好，能夠迅速適應不良環境，占據優勢[16]。這兩種乳酸菌在干酪成熟過程中的作用非常重要，可以產生小肽、游離氨基酸和游離脂肪酸，直接影響干酪風味或者是作為風味化合物的前體間接影響干酪風味[17]。對腸桿菌的計數是判斷產品是否處于良好衛生狀況的重要指標之一。如果干酪中腸桿菌的數目較高，說明在干酪生產中的衛生情況較差[14]。在干酪成熟初期，干酪A、B、C都有腸桿菌的檢出，不到1個數量級，可能是和干酪加鹽的過程有關。葡萄球菌和沙門氏菌在干酪成熟過程中一直沒有檢出，也沒有發現干酪成熟時變質的表象。

3 結論

通過SPME-GC-MS方法對硬質蒙古干酪中的揮發性風味化合物進行了分離檢測，在不同成熟期內各化合物呈現動態變化。發酵劑使用量對干酪風味會產生影響，當使用量為1.5 g/L原料乳時，酸類化合物會大量產生，導致干酪酸味較重。而使用量為1.0 g/L原料乳時，其成熟過程中風味化合物種類多于使用量為0.5 g/L原料乳，組分更為豐富，風味更加均勻適中，可以形成更好的風味。

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[7]GB 4789.18—2010 食品安全國家標準食品微生物學檢驗—乳與乳制品檢驗.

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