冷凍面團中酵母抗凍保護劑的優選

葉 鵬，王學東 *，宋勁松，陳聰莉，王玉東，彭思源，陳 摯

（1.武漢輕工大學 食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023；2.武漢市仟吉食品有限公司，湖北 武漢 430023）

冷凍面團是20世紀50年代發展起來的一種面制品加工新技術，它利用抗凍能力強的面包酵母進行發酵，工藝上把面團制作和產品的烘烤或蒸制兩個環節分開，非常適合連鎖店的經營，它不僅擴大了面制品廠的生產規模，為連鎖店節約了場地、設備、人力和時間，降低了產品的成本，方便了消費者能隨時吃到新鮮的面包等發酵類面食[1-2]。低溫速凍和冷藏過程會對面筋結構和酵母產生較大損傷，使得冷凍面團制成品常常伴有體積小、口感不好、結構粗糙等缺陷[3]。一方面，可以通過改進工藝條件和添加改良劑來改善面團品質特性，如乳化劑、氧化劑、酶制劑、膠體和磷酸鹽類等[4-6]；另一方面，通過基因工程[7]、輻照誘變和雜交[8]等生物學方法選擇耐凍酵母或添加酵母抗凍保護劑來減少酵母損傷，提高產品品質。國內外已有不少學者進行了大量的抗凍酵母篩選工作。但是，獲得的耐冷凍酵母制作出的面包風味和口感與普通酵母制得的產品相比都比較差，且基因工程菌在食品領域仍存在較大爭議。

陳麗君等[9]發現面包酵母胞內海藻糖與其耐鹽性、耐凍性等耐受性存在一定的相關性，海藻糖含量越高，酵母耐性越好。SASANO Y等[10]探究發現篩選出能同時累積海藻糖和脯氨酸的耐凍酵母，其發酵力高于單獨累積海藻糖或脯氨酸。其他的抗凍保護劑還包括小分子糖類[11]、甘油[12]和部分帶電氨基酸[13-14]等，試驗選取的幾種抗凍保護劑成本低、安全性高、且部分還有營養強化的功效，故可外源添加抗凍保護劑保護冷凍面團中的酵母。該研究通過單因素試驗、旋轉正交組合設計[15]優選酵母抗凍保護劑，確定最佳的保護劑組合，為酵母的耐凍性研究提供一定的理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高筋小麥粉：武漢仟吉食品有限公司（水分13.3%，粗蛋白11.9%，濕面筋35.6%）；高糖干酵母：安琪酵母股份有限公司；葡萄糖、濃硫酸、NaCl均為分析純：國藥集團化學試劑有限公司；酵母提取物、蛋白胨、瓊脂糖：北京奧博星生物技術有限公司；海藻糖、甘油、L-脯氨酸、白砂糖均為食品級：深圳恒生生物科技有限公司。

酵母浸出粉胨葡萄糖培養基（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）：酵母提取物1%、葡萄糖2%、蛋白胨2%、瓊脂糖2%，121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

BS22422分析天平：北京賽多利斯儀器系統有限公司；DW-40L188醫用低溫保存箱：青島海爾特種電器有限公司；JB1-5F型急速冷凍柜：上海金城制冷設備有限公司；XH-C漩渦混合儀：金壇市精達儀器制造有限公司；LRHS-150-Ⅱ型恒溫恒濕培養箱：上海躍進醫療器械有限公司；HNY-200B型恒溫培養振蕩器：天津市歐諾儀器儀表有限公司；YX280A型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器：上海三申醫療器械有限公司；HHS-2S型電子恒溫不銹鋼水浴鍋：天津虞龍儀器設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 面團的制備

面粉150 g，水80 mL，糖20 g，鹽1.4 g，酵母2 g。再分割面團為80 g/個，在-35 ℃在速凍1 h后，在-20 ℃低溫冰箱貯存7 d。

1.3.2 酵母存活率的測定[16]

取若干個100 mL錐形瓶，分別倒入50 mL YPD液體培養基，除空白組外，試驗組添加一定量的抗凍保護劑，再用滅菌鍋121 ℃條件下殺菌15 min；待培養基冷卻后分別加入1 g干酵母，溶解混勻，30 ℃恒溫搖床（150 r/min）培養14 h。

取1 mL培養液，進行適當的梯度稀釋，再接種到YPD固體培養基上，30 ℃培養箱中培養48 h，取出然后用直接計數法數出培養皿中的菌落數，為凍前細胞數N1；取5 mL培養液于-30 ℃下冷凍7 d，再取出于30 ℃下解凍3～5 min，進行同等梯度稀釋后接種在YPD固體培養基，30 ℃培養箱中培養48 h，取出后計數，為凍后細胞數N2，平行計數3次。酵母存活率=N1/N2×100%。

1.3.3 發酵力的測定

圖1 發酵力測定裝置Fig.1 Testing device of fermentation capacity

根據GB/T 20886—2007《食品加工用酵母》測定酵母細胞在鮮面團和冷凍面團中的發酵力，實驗裝置如圖1所示。測定方法：將制備好的冷凍面團迅速放入A瓶中，恒溫水浴30 ℃解凍并發酵，C瓶收集排出液并讀數，發酵前3 h排出液的體積即為酵母發酵力，mL。

1.3.4 單因素試驗

選擇海藻糖、甘油、NaCl、脯氨酸、葡萄糖5種抗凍保護劑（以質量分數計），在-30 ℃下冷凍7 d后測定酵母存活率和發酵力兩個指標進行單因素試驗，不同酵母抗凍保護劑的添加水平見表1。

表1 保護劑配方優化單因素試驗Table 1 Factors and levels of single factor experiments for protectant formula optimization

1.3.5 二次旋轉正交試驗

根據1.3.1和1.3.2中的試驗方法，以冷凍時間為7 d測存活率和發酵力兩個指標，通過單因素試驗篩選出抗凍性較好的3種抗凍保護劑及其因素水平，再進行3因素二次回歸旋轉正交試驗優化保護劑配方，因素與水平編碼見表2。

表2 二次旋轉正交試驗因素與水平編碼Table 2 Factors and levels of quadratic rotation orthogonal experiments

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 空白試驗

空白試驗結果見表3。由表3可知，空白組試驗酵母存活率為30.12%，發酵力為180 mL。

表3 空白組試驗結果Table 3 Results of blank test

2.1.2 海藻糖對試驗結果的影響

海藻糖添加量對酵母存活率和發酵力的影響見圖2。由圖2結果可知，冷凍7 d后，酵母的存活率和發酵力在海藻糖添加量為1%～5%范圍內是先上升后下降的趨勢。且當海藻糖添加量為2%時，存活率和發酵力均是最高的，存活率為64.34%，發酵力為256 mL；與空白組相比，存活率提高了34個百分點，發酵力提高了80 mL左右。

圖2 海藻糖添加量對存活率和發酵力的影響Fig.2 Effect of trehalose addition on survival rates and fermentation capacity

2.1.3 甘油對試驗結果的影響

甘油添加量對酵母存活率和發酵力的影響見圖3。由圖3結果可知，冷凍7 d后，酵母的存活率和面團的發酵力在甘油添加量為1%～9%范圍內是先上升后下降的趨勢。且當甘油添加量為3%時，存活率和發酵力均是最高的，存活率為65.98%，發酵力為262 mL；與空白組相比，酵母存活率上升了36個百分點，發酵力提高了80 mL左右。

圖3 甘油添加量對存活率和發酵力的影響Fig.3 Effect of glycerol addition on survival rates and fermentation capacity

2.1.4 NaCl對試驗結果的影響

NaCl添加量對酵母存活率和發酵力的影響見圖4。由圖4可知，冷凍7 d后，酵母的存活率和面團的發酵力在NaCl添加量為1%～9%范圍內呈一直下降的趨勢，當添加量為1%時效果最佳，存活率為61.94%，發酵力為220 mL；說明鹽含量過高不利于酵母存活和面團發酵。當添加量為1%時，與空白組相比，酵母存活率提高了32個百分點，發酵力提高了40 mL左右。

圖4 NaCl添加量對存活率和發酵力的影響Fig.4 Effect of NaCl addition on survival rates and fermentation capacity

2.1.5 脯氨酸對試驗結果的影響

脯氨酸添加量對酵母存活率和發酵力的影響見圖5。由圖5結果可知，冷凍7 d后，酵母的存活率和發酵力在脯氨酸添加量為1%～5%范圍內是先上升后下降的趨勢。且當添加量為2%時，存活率和發酵力均是最高的，存活率為66.32%，發酵力為254 mL；與空白組相比，酵母存活率提高了36個百分點，發酵力提高了70 mL左右。

圖5 脯氨酸添加量對存活率和發酵力的影響Fig.5 Effect of proline addition on survival rates and fermentation capacity

2.1.6 葡萄糖對試驗結果的影響

圖6 葡萄糖添加量對存活率和發酵力的影響Fig.6 Effect of glucose addition on survival rates and fermentation capacity

葡萄糖對酵母存活率和發酵力的影響見圖6。由圖6結果可知，冷凍7 d后，酵母的存活率和發酵力在海藻糖添加量為2%～10%范圍內是先上升后下降的趨勢。且當添加量為4%時，存活率和發酵力均是最高的，存活率為62.04%，發酵力為238 mL；與空白組相比，酵母存活率提高了31個百分點，發酵力提高了60 mL左右。

2.2 二次回歸正交優化試驗

2.2.1 正交試驗設計

綜合評定5個單因素的存活率和發酵力指標，獲得較好的3種酵母抗凍保護劑及其添加量分別是：海藻糖2%、甘油3%和脯氨酸2%。在此基礎上進行二次旋轉正交試驗，結果見表4。

表4 二次旋轉正交組合設計編碼及試驗結果Table 4 Coding and results of quadratics rotary orthogonal combination design

2.2.2 方差分析

以存活率和發酵力為評價指標，建立二次多項模型及對各項進行方差分析，結果分別見表5和表6。

由表5可知，除交互項x2x3外，回歸方程及各項偏回歸系數都達到顯著水平。其中因素x1、x2、x3和x1x2都影響極顯著，說明海藻糖、甘油、脯氨酸及海藻糖和甘油的交互作用對存活率的影響非常顯著；x1x3為顯著，說明海藻糖和甘油的交互作用對存活率的影響顯著；x2x3為不顯著，說明甘油和脯氨酸的交互作用對存活率的影響不大。

由表6可知，除交互項x1x3外，回歸方程及各項偏回歸系數都達到顯著水平。其中因素x1、x2、x3和x1x2都影響極顯著，說明海藻糖、甘油、脯氨酸及海藻糖和甘油的交互作用對發酵力的影響非常顯著；x2x3為顯著，說明甘油和脯氨酸的交互作用對發酵力的影響顯著；x1x3為不顯著，說明海藻糖和脯氨酸的交互作用對發酵力的影響不大。

表5 以存活率為評價指標的方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal experiment based on survival rates as index

表6 以發酵力為評價指標的方差分析Table 6 Variance analysis of orthogonal experiment based on survival rates as index

利用EXCEL數據處理工具做回歸分析，得到回歸方程結果見表7。

表7 存活率和發酵力回歸分析Table 7 Regression analysis of survival rate and fermentation capacity

利用DPS軟件對二次旋轉正交試驗進行分析，得到最佳抗凍劑的組合為x1=2.23，x2=3.43，x3=1.55。在此條件下進行驗證試驗，得到實驗結果與預測值都較為接近。即海藻糖、甘油和脯氨酸添加量分別為2.23%、3.43%和1.55%時，酵母存活率和面團發酵力結果較優，存活率為85.86%，發酵力為322 mL。

3 結論

在單因素試驗基礎上，運用三因素二次回歸正交旋轉設計進行優選試驗。根據顯著回歸方程，在對存活率影響試驗中，因素主次順序為：海藻糖＞甘油＞脯氨酸；在對發酵力影響試驗中，因素主次順序為：海藻糖＞脯氨酸＞甘油。綜合存活率、發酵力和經濟角度考慮，驗證得到最優試驗條件為：海藻糖、甘油和脯氨酸添加量分別為2.23%、3.43%和1.55%，在此條件下酵母存活率和面團發酵力結果較優，存活率為85.86%，發酵力為322 mL。

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