酶法提取米糠蛋白工藝的研究

蔡騰龍，占劍峰，2*

（1.黃岡師范學院 生命科學學院，湖北 黃岡 438000；2.黃岡師范學院 大別山特色資源開發湖北省協同創新中心，湖北 黃岡 438000）

米糠是稻谷加工的副產品，其質量占稻谷粒質量的5.0%～5.5%。我國擁有豐富的米糠資源，米糠的年產量超過1 000萬t，是一種量大面廣的可再生資源[1]。而在米糠中，蛋白質的含量可達到18%。米糠蛋白營養價值高且是已知的過敏性較低的蛋白質之一，它的必需氨基酸的種類齊全，特別是賴氨酸含量更接近聯合國糧農組織/世界衛生組織（food and agriculture organization/world health organization，FAO/WHO）推薦模式[2-3]，補償了谷物蛋白中賴氨酸不足的缺陷，大大提高了米糠蛋白的營養價值，使其成為可以與動物蛋白相媲美的優質植物蛋白質[4-5]。在食品中，米糠蛋白可以應用于功能性食品、嬰兒配方食品[6，11]、食品添加劑[7]、可食性膜[8-10]、生產替代谷氨酸鈉風味肽、蛋白飲料保健食品、營養強化劑、功能性多肽等。因此，優化米糠蛋白的提取工藝，具有重要現實意義[11]。

由于米糠中蛋白質的溶解性較差，在提取和分離純化時難度較大，造成提取率及純度皆不高。提取米糠蛋白的主要方法有堿法、物理法和酶法[12]。堿法提取米糠蛋白時，強堿會引起蛋白中賴氨酸的損失，還會產生一些有害的副產物如賴氨酰丙氨酸，這會損害其營養價值[13]。另外，堿液造成蛋白質變性和水解；增加美拉德反應的程度使蛋白質的顏色變黑[14-15]，造成蛋白質商用品質降低。而物理方法提取蛋白質提取率比較低[16]。酶法提取米糠中的蛋白質具有提取時間短、反應條件溫和、不易產生有害物質和能更多保留蛋白質的營養價值等優點。本研究以蛋白提取率為依據，采用響應面分析法對酶法提取米糠蛋白工藝進行研究，考察酶解時間、酶解溫度、pH值和液料比對米糠蛋白提取率的影響，旨在為酶法提取米糠蛋白的最佳工藝確定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米糠：市售；纖維素酶（10 000 U/g）、復合蛋白酶（100 000 U/g）：天津眾信生物科技有限公司；磷酸氫二鈉、檸檬酸、乙醇、磷酸、濃硫酸、鹽酸、無水硫酸銅、硫酸鉀、硼酸均為分析純：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

PB2002-10型電子天平：上海民橋精密科學儀器有限公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋、GZX-9240 MBE型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；722s型可見分光光度計：上海棱光技術有限公司；SC-2546型低速離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；Kjeltec8400型凱氏定氮儀：丹麥FOSS；KL-009ATC型pH計：上海比郎儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取工藝流程

米糠→pH值為5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液緩沖液中溶解→添加纖維素酶和復合蛋白酶（添加量各為2%）→保溫（50 ℃，2.5 h）→滅酶（100 ℃10 min）→4 000 r/min離心15 min →取上清液→測定→干燥→米糠蛋白

1.3.2 蛋白質含量的測定

凱氏定氮法測米糠粗蛋白參考GB/T 5511—2008《谷物和豆類 氮含量測定和粗蛋白含量計算 凱氏法》[17]。

1.3.3 提取條件優化單因素試驗

（1）液料比對蛋白質提取率的影響

提取時間2.5 h，提取溫度50 ℃，pH值為5.0時，考察不同液料比（mL∶g）（8∶1、9∶1、10∶1、11∶1、12∶1）對蛋白質提取率的影響。

（2）pH值對蛋白質提取率的影響

提取時間2.5 h，提取溫度50 ℃，液料比10∶1（mL∶g）時，考察不同pH值（4.6、4.8、5.0、5.2、5.4）對蛋白質提取率的影響。

（3）提取時間對蛋白質提取率的影響

在液料比10∶1（mL∶g），提取溫度50 ℃，pH值為5.0時，考察不同提取時間（1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h）對蛋白質提取率的影響。

（4）提取溫度對蛋白質提取率的影響

在提取時間2.5 h，液料比10∶1（mL∶g），pH值為5.0時，考察不同提取溫度（40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃）對蛋白質提取率的影響。

1.3.4 提取條件優化響應面試驗

在單因素試驗結果的基礎上，利用Design Expert 軟件，采用中心組合試驗Box-Behnken設計方案，以酶解溫度、酶解時間、pH值和液料比為響應因子，以米糠蛋白提取率為響應值，進行4因素3水平試驗，試驗設計因素和水平見表1。

表1 蛋白提取工藝優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis for protein extraction process optimization

2 結果與分析

2.1 提取條件對蛋白質提取率的影響

2.1.1 液料比對蛋白質提取率的影響

圖1 液料比對米糠蛋白質提取率的影響Fig.1 Effect of liquid-solid ratio on extraction rate of rice bran protein

由圖1可知，隨著液料比的升高，米糠蛋白提取率有不同程度的增加，當液料比增加至10∶1（mL∶g）后，蛋白提取率開始下降，由于液料比超過10∶1（mL∶g）后，米糠顆粒與液體的接觸達到了飽和狀態，再增加液料比，也不會提高米糠蛋白的溶出，反而由于液料比過大，為后續離心、濃縮和過濾過程帶來困難，降低了米糠蛋白的提取率，因此確定液料比為10∶1（mL∶g）。

2.1.2 pH值對蛋白質提取率的影響

由圖2可知，當pH值＜5.0時，米糠蛋白質的提取率呈遞增趨勢，這是因為pH值對水分子的作用表現為吸引力，所以米糠蛋白能被不斷提取出來；當pH值＞5.0后，其對水分子的作用表現為排斥力，米糠蛋白會隨著排斥力的增加而逐漸脫離水分子，故其提取率呈下降趨勢。所以，最終確定pH值為5.0。

圖2 p H值對米糠蛋白質提取率的影響Fig.2 Effect of pH on extraction rate of rice bran protein

2.1.3 酶解時間對蛋白質提取率的影響

由圖3可知，酶解時間＜2.5 h時，米糠蛋白的提取率呈遞增趨勢，這是因為隨著時間的增加，米糠蛋白能夠被不斷浸提出。當酶解時間＞2.5 h后，隨著提取時間的延長，使得米糠與緩沖液呈黏稠狀，并蒸發一部分含有米糠蛋白的液體，同時也為后續離心造成困難，其提取率逐漸降低。因此，選擇酶解時間為2.5 h最為適宜。

圖3 酶解時間對米糠蛋白質提取率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis time on extraction rate of rice bran protein

2.1.4 酶解溫度對蛋白質提取率的影響

圖4 酶解溫度對米糠蛋白質提取率的影響Fig.4 Effect of temperature on extraction rate of rice bran protein hydrolysis

由圖4可知，在50 ℃時蛋白提取率較高，但溫度＞50 ℃時蛋白提取率明顯下降，這是由于溫度過高引起的部分纖維素酶失活，酶解效果減弱且當溫度超過50 ℃時，淀粉開始糊化，阻礙了米糠蛋白的提取，所以提取率開始下降。因此，選擇50 ℃的酶解溫度最為適宜。

2.2 響應面試驗結果與分析

以酶活力為響應值Y，通過Design-Expert 軟件對試驗結果進行響應曲面分析，結果見表2，方差分析見表3。

采用Design Expert統計軟件對模型以及回歸方程進行顯著性檢驗。由表3可知，4個因素對米糠蛋白的提取率的影響的重要性次序依次為：液料比＞pH值＞酶解時間＞酶解溫度。通過軟件對表2中的數據進行二次多元回歸擬合，得到米糠蛋白提取率對A、B、C和D的二次多項回歸方程為：

表2 蛋白提取工藝優化響應面試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of response surface analysis for protein extraction process optimization

表3 響應面試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface methodology

根據試驗結果進行方差分析，從表3可以看出，大米蛋白的提取率回歸模型的F值為31.96，P＜0.01，達到極其顯著水平；而失擬項的F值為5.25，P值為0.062 2＞0.05，影響不顯著，說明該模型擬合結果良好。一次項A、C，交互項AB、BC和二次項A2、B2、C2、D2的影響都是極顯著的，一次項B、D和交互項CD對結果影響顯著，交互項AC、AD、BD影響不顯著。方程的決定系數R2=0.919 3，這表明用上述回歸方程描述各因素與響應值之間的關系時，其因變量和全體自變量之間的關系顯著。對交互作用顯著的因素進行分析，得到響應面及等高線圖見圖5。

圖5 酶解時間、酶解溫度、pH值和液料比對米糠蛋白提取率影響的響應曲面圖和等高線圖Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of reaction time,pH,temperature and liquid-solid ratio on rice bran protein extraction rate

采用響應面分析可知，酶法提取米糠蛋白的最佳工藝條件為液料比10.23，pH值5.06，酶解溫度48.80 ℃，酶解時間2.40 h。在此條件下得到米糠蛋白質的提取率為39.69%。

2.3 驗證試驗

為了檢驗響應曲面法所得結果的可靠性，采用上述優化的測定條件進行酶法提取米糠蛋白的試驗，考慮到實際的操作情況，將測定的條件修正為液料比10∶1（mL∶g），pH值5.0，酶解溫度50 ℃，酶解時間2.5 h。在此條件下測試3次，得到米糠蛋白質的平均提取率為39.54%，實際值與理論值的相近，可見該模型可以很好地反映各因素對米糠蛋白質的提取率的影響，同時也證明了用該方法研究米糠蛋白質的提取率的可行性。

3 結論

通過酶法提取米糠中的蛋白質，在纖維素酶及復合蛋白酶添加量均為2%條件下，通過對液料比，pH值，酶解溫度，酶解時間進行單因素試驗，同時利用Design Expert軟件進行試驗設計。采用Box-Benhnken中心組合試驗設計和響應面分析法，得到酶法提取米糠蛋白的最佳工藝參數為：液料比10∶1（g∶mL），pH值5.0，酶解溫度50 ℃，酶解時間2.5 h。在此條件下得到米糠蛋白質的提取率為39.54%。本試驗工藝流程酶法提取米糠蛋白溫度低；反應時間短；對米糠蛋白變性、水解、營養的影響小；能更好地保存其營養價值；此外，酶法提取米糠蛋白產生的廢液少，能降低工業化生產的成本，同具有較好的前景。

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