面筋中腐敗微生物的分離和鑒定的研究

許喜林，鄒彥桐，王蔚瑜

（華南理工大學(xué) 輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640）

面筋是生產(chǎn)淀粉的副產(chǎn)品，含有豐富的植物蛋白質(zhì)資源，很早就被人們廣泛食用，1745年意大利科學(xué)家BECCAI就發(fā)現(xiàn)了面筋[1]。面筋是一種復(fù)雜的蛋白質(zhì)復(fù)合物，是小麥能夠制成特有食品的物質(zhì)基礎(chǔ)[2]。對(duì)于許多素食主義者來說，動(dòng)物蛋白的攝入量較少，因此面筋變得尤為重要，目前面筋在西方國(guó)家也逐漸進(jìn)入市場(chǎng)。面筋制品在保證人群營(yíng)養(yǎng)均衡，特別是對(duì)于蛋白質(zhì)的攝取具有非常重要的意義[3]。

由于面筋的營(yíng)養(yǎng)成分尤其是蛋白質(zhì)的含量較高，為微生物提供了良好的生長(zhǎng)條件，一旦加工中殺菌不徹底或者儲(chǔ)藏條件不當(dāng)，就極易引起面筋的腐敗變質(zhì)，影響面筋的品質(zhì)，使得面筋產(chǎn)品的保質(zhì)期變短。因此，研究面筋中的腐敗微生物具有意義。本研究對(duì)面筋中的腐敗微生物進(jìn)行分離純化，通過菌落觀察，革蘭氏染色，V-P試驗(yàn)等方法從形態(tài)學(xué)和生理生化特性上初步鑒定了導(dǎo)致面筋腐敗的主要腐敗生物，為面筋產(chǎn)品的防腐保藏提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

面粉：山東魯王集團(tuán)有限公司。

1.1.2 試劑

氯化鈉（分析純）：江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；瓊脂：廈門星隆達(dá)化學(xué)試劑有限公司；氯霉素（分析純）：湖北眾誠(chéng)藥業(yè)有限公司；葡萄糖、氧化酶試紙、V-P試劑、革蘭氏染色試劑、胰蛋白胨、硝酸鹽：廣州環(huán)凱微生物科技有限公司；磷酸氫二鉀（分析純）：天津市啟聯(lián)精細(xì)化學(xué)有限公司；磷酸氫二銨（分析純）：天津福晨化學(xué)試劑廠；氯化鉀（分析純）、硫酸鎂（分析純）：廣州化學(xué)試劑廠；可溶性淀粉（化學(xué)純）：江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；丙酸鈣（分析純）：天津市永大化學(xué)實(shí)際開發(fā)中心；酵母膏：上海中科昆蟲生物技術(shù)開發(fā)有限公司；D-木糖、甘露醇：上海伯奧生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

分離和計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（nutrient agar，NA）、平板計(jì)數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA）培養(yǎng)基、固體馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基、孟加拉紅（虎紅）瓊脂培養(yǎng)基。

生化鑒定培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（nutrient broth，NB）、V-P試驗(yàn)培養(yǎng)基、芽孢菌培養(yǎng)基、淀粉水解培養(yǎng)基、明膠水解培養(yǎng)基、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基、檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基、丙酸鹽培養(yǎng)基、吲哚實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基等，按照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[4]和《食品微生物實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》[5]配制。

1.2 儀器與設(shè)備

pHS-25型精密pH計(jì)：上海精密科學(xué)有限公司；JJ3000型電子天平：廣州市芊薈化玻璃儀器有限公司；XSP-3CA型單目生物顯微鏡：上海光學(xué)儀器六廠；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；WMK-02型電熱恒溫培養(yǎng)箱：南京實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 面筋的制作工藝

面粉/水（質(zhì)量比5∶2）→和面→醒發(fā)（室溫靜置30 min）→制取（淋水揉洗3～5次）→面筋[6]。

1.3.2 面筋中微生物生長(zhǎng)狀況研究

將濕面筋切成大小均勻的塊狀，分別采用100℃、110℃、120 ℃滅菌30 min處理。稱取不同溫度下滅菌的一定質(zhì)量的面筋，加水均質(zhì)，稀釋至相鄰3個(gè)梯度濃度，吸取1 mL的不同濃度的稀釋液分別倒入滅菌后冷卻至45～50 ℃的PDA培養(yǎng)基、虎紅培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。然后酵母菌和霉菌培養(yǎng)基放置28 ℃中恒溫培養(yǎng)3～5 d，細(xì)菌培養(yǎng)基在36 ℃中培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果。

稱取面筋5 g，放入45 mL的無菌水中，均質(zhì)并稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5共5個(gè)稀釋梯度，吸取1 mL稀釋液到培養(yǎng)皿，傾倒經(jīng)滅菌后冷卻至45～50 ℃的PCA培養(yǎng)基，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行。凝固后在36 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h進(jìn)行計(jì)數(shù)[7]。

1.3.3 面筋中腐敗微生物的分離純化與腐敗驗(yàn)證

在無菌條件下，稱取變質(zhì)面筋5 g置于45 mL的無菌水中，均質(zhì)并稀釋至10-1、10-2、10-3，吸取1 mL傾倒至經(jīng)過121 ℃滅菌冷凝的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，于36 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后挑取可疑菌落進(jìn)行反復(fù)劃線直至分離出單菌落。

挑取所有可疑菌落接種于經(jīng)過120 ℃滅菌30 min的面筋中，放置于36 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔12 h觀察面筋的感官情況[8]，是否出現(xiàn)顏色變深、黏稠、惡臭氣味等腐敗現(xiàn)象。按照上述方法，對(duì)面筋進(jìn)行菌落總數(shù)計(jì)數(shù)。

1.3.4 面筋中腐敗微生物的觀察及生理生化鑒定

在無菌條件下，將已經(jīng)融化并冷卻到40～50 ℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基按無菌操作倒入培養(yǎng)皿中，冷卻凝固后，用無菌接種環(huán)取少許菌在平板表面劃線，以便長(zhǎng)出單菌落。在36 ℃在培養(yǎng)24 h，然后觀察以下特征：?jiǎn)尉涞念伾⒋笮『托螤睢⑼该鞫取⑦吘墶⒈砻嫱黄鹦螤睢こ矶群蜌馕兜取?duì)于分離出來的18株菌進(jìn)行分類鑒定，根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[4]、《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[9]、《食品微生物實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》[5]中提供的方法，鑒定項(xiàng)目包括菌落的形態(tài)特征和生理生化特征[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 面筋中微生物生長(zhǎng)狀況研究

采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、虎紅瓊脂培養(yǎng)基，對(duì)腐敗面筋進(jìn)行微生物培養(yǎng)，各種培養(yǎng)基表面微生物的生長(zhǎng)情況如表1所示。

表1 細(xì)菌和真菌培養(yǎng)基中微生物生長(zhǎng)情況Table 1 The microorganisms growth in bacterial and fungal mediumCFU/g

由表1可知，經(jīng)過不同溫度滅菌的面筋樣品經(jīng)過24 h的放置后進(jìn)行微生物培養(yǎng)，添加氯霉素的固體PDA培養(yǎng)基和虎紅培養(yǎng)基都沒有微生物生長(zhǎng)，而在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，經(jīng)過120 ℃滅菌30 min的面筋沒有微生物生長(zhǎng)，而100 ℃、110 ℃滅菌30 min處理的面筋微生物生長(zhǎng)良好，菌落近圓形，呈乳黃色或乳白色，直徑2～6 mm，表面粗糙干燥或濕潤(rùn)黏稠，半透明或不透明，邊緣形態(tài)各異，基本判斷是面筋中的腐敗微生物。

2.2 面筋中腐敗微生物的分離純化與腐敗驗(yàn)證

在面筋腐敗微生物分離的研究中，經(jīng)過反復(fù)劃線分離共挑取18株單菌落可疑菌。在腐敗驗(yàn)證試驗(yàn)中，每一株可疑菌分別接入經(jīng)過120 ℃滅菌30 min的面筋中，同時(shí)以不接種細(xì)菌作為對(duì)照，在36 ℃培養(yǎng)24 h后觀察現(xiàn)象，結(jié)果見表2。

表2 面筋腐敗驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The verification test results of wheat gluten spoilage

由表2可知，空白對(duì)照保留面筋原有的奶黃色，而其他所有面筋表面有明顯的白色絮狀物質(zhì)生長(zhǎng)，面筋顏色由乳黃色變?yōu)樯钌⑶叶籍a(chǎn)生刺鼻的臭味。對(duì)面筋進(jìn)行菌落總數(shù)計(jì)數(shù)，每組面筋的菌落總數(shù)都超出國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（≤1×105CFU/g）[11]。

2.3 面筋中腐敗微生物的觀察及生理生化鑒定

通過種水平和屬水平的生理生化鑒定結(jié)果，確定菌株No.1、No.5、No.6、No.14、No.16、No.17為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），菌株No.2、No.3、No.4、No.7、No.8為蕈狀芽孢桿菌（Bacillus mycoidesFlugge），菌株No.9、No.11、No.12、No.13、No.15為枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis），菌株No.10、No.18為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）。選取菌株No.1、No.3、No.9、No.18為代表菌，菌落形態(tài)見圖1所示。

圖1 面筋腐敗微生物的菌落形態(tài)Fig.1 The morphology characteristics of the spoilage microorganisms in wheat gluten

由圖1可知，菌株No.1，菌落呈近圓形，直徑3～4 mm，邊緣呈鋸齒狀，表面干燥，乳白色，不透明。菌株No.3，菌落呈圓形，直徑4～6 mm，邊緣菌絲狀，有同心環(huán)，淡黃色，不透明。菌株No.9，菌落呈不規(guī)則形，直徑3～5 mm，邊緣傘邊狀，表面皺褶，乳白色，不透明。菌株No.18，菌落呈近圓形，直徑3～4 mm，邊緣菌絲狀，表面粗糙，有同心環(huán)，乳白色，不透明[11]。

本研究對(duì)18株面筋腐敗微生物進(jìn)行革蘭氏染色進(jìn)行鏡檢結(jié)構(gòu)顯示，細(xì)胞單個(gè)呈現(xiàn)桿狀，整體呈鏈狀排列，染色結(jié)果為紫色，屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，芽孢呈中生、端生或偏端生，孢囊無明顯膨大，能在多種不良環(huán)境中生長(zhǎng)，每個(gè)細(xì)胞只有一個(gè)內(nèi)生芽孢，屬于芽孢桿菌。以菌株No.1、No.3、No.9、No.18為代表菌，革蘭氏染色結(jié)果見圖2，生理生化試驗(yàn)結(jié)果見表3。

圖2 革蘭氏染色鏡檢結(jié)果以及形態(tài)特征Fig.2 Results of Gram-stain test and characteristics of cellular morphology

由圖2可知，菌株No.1，桿狀，長(zhǎng)鏈狀，產(chǎn)芽孢，橢圓形，偏端生，孢囊不膨大。菌株No.3，短桿狀，短鏈狀，產(chǎn)芽孢，橢圓形，中生或端生，孢囊無明顯膨大。菌株No.9，桿狀，鏈狀，產(chǎn)芽孢，橢圓形或柱形，中生或偏端生，孢囊不膨大。菌株No.18，短桿狀，團(tuán)狀或短鏈狀，橢圓形，芽孢中生或端生，孢囊無明顯膨大。

表3 腐敗菌株的生理生化結(jié)果Table 3 The physiological and biochemical characteristics of spoilage microorganisms

由表3可知，菌株No.1的氧化酶實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)為陰性，能利用D-葡萄糖、D-木糖和D-甘露醇，接觸酶試驗(yàn)、V-P實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽利用、丙酸鹽利用、水解淀粉、水解明膠均為陽(yáng)性，在30 ℃、40 ℃、50 ℃能生長(zhǎng)，在5 ℃則不能生長(zhǎng)，在7%、10%的高鹽環(huán)境中生長(zhǎng)良好，在pH 5.7的營(yíng)養(yǎng)肉湯里生長(zhǎng)良好，因此判斷以菌株No.1為代表的一類為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。

菌株No.3氧化酶實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)為陰性為陽(yáng)性，能利用D-葡萄糖，不能利用D-木糖和D-甘露醇，接觸酶實(shí)驗(yàn)、V-P實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽利用、丙酸鹽利用、水解淀粉、水解明膠均為陽(yáng)性，在30 ℃、40 ℃能生長(zhǎng)，而在5 ℃、50 ℃停止生長(zhǎng)，在7%、10%的高鹽環(huán)境中生長(zhǎng)良好，在pH 5.7的營(yíng)養(yǎng)肉湯里生長(zhǎng)良好，因此判斷以菌株No.3為代表的一類為蕈狀芽孢桿菌（Bacillus mycoides）。

菌株No.9氧化酶實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)為陰性，能利用D-葡萄糖、D-甘露醇、D-木糖，接觸酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽利用、水解淀粉、水解明膠均為陽(yáng)性，丙酸鹽利用為陰性，在30 ℃、40 ℃能生長(zhǎng)，在5 ℃、50 ℃停止生長(zhǎng)，在7%、10%的高鹽環(huán)境中生長(zhǎng)良好，在pH 5.7的營(yíng)養(yǎng)肉湯生長(zhǎng)良好，因此判斷以菌株No.9為代表的一類為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

菌株No.18氧化酶實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、V-P實(shí)驗(yàn)為陰性，且V-P終產(chǎn)物pH＞6，不能利用D-甘露醇，能利用D-木糖、D-葡萄糖，硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽反應(yīng)、接觸酶實(shí)驗(yàn)、丙酸鹽利用、水解淀粉、水解明膠均為陽(yáng)性，在30 ℃、40 ℃能生長(zhǎng)，在5 ℃、50 ℃停止生長(zhǎng)或不能生長(zhǎng)，在7%、10%的高鹽環(huán)境中生長(zhǎng)良好，在pH 5.7的營(yíng)養(yǎng)肉湯里生長(zhǎng)良好，因此判斷以菌株No.18為代表的一類為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）[13]。

3 結(jié)論

對(duì)面筋中腐敗微生物進(jìn)行分離純化后，得到18枝菌株，經(jīng)菌落形態(tài)觀察，革蘭氏染色等生理生化指標(biāo)檢測(cè)，初步鑒定該18株菌均為芽孢桿菌（Bacillus），菌株No.1、No.5、No.6、No.14、No.16、No.17為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），菌株No.2、No.3、No.4、No.7、No.8為蕈狀芽孢桿菌（Bacillus mycoides），菌株No.9、No.11、No.12、No.13、No.15為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），菌株No.10、No.18為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）。

本研究選取簡(jiǎn)單的方法對(duì)面筋中的腐敗微生物進(jìn)行分離鑒定，進(jìn)而研究其生長(zhǎng)特性，判斷面筋中腐敗微生物的種類，為面筋腐敗控制，防腐劑種類的選擇提供依據(jù)。從現(xiàn)實(shí)意義上，由于面筋的制作場(chǎng)地大多都是作坊式的小行業(yè)，衛(wèi)生條件差，且沒有形成較大規(guī)模，投入成本較低[14]，無法保證使用統(tǒng)一的生產(chǎn)工藝來進(jìn)行防腐，導(dǎo)致對(duì)于面筋的研究較少，尤其是對(duì)于研究面筋中的腐敗微生物的研究更是少之又少，對(duì)面筋中腐敗微生物研究可以為面筋防腐研究提供理論依據(jù)，從而更好的保障面筋制品的質(zhì)量，對(duì)于小麥制品開發(fā)利用也具有意義[15]。

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