擬青霉WPG-1的鑒定及固體發酵產β-1,3-1,4-葡聚糖酶條件的優化

唐艷斌，胡婉峰*

（1.華中農業大學 食品科學與技術學院，湖北 武漢 430070；2.中國疾病預防控制中心 營養與健康所，北京 100050；3.國家衛生計生委 微量元素重點實驗室，北京 100050）

β-葡聚糖（glucan）是以β-葡萄糖殘基通過β-1,3和β-1,4糖苷鍵以一定的比例連接而成的線性分子，在大麥、燕麥、高粱、大米和小麥等谷物的胚乳細胞壁中的含量尤其豐富[1]。β-葡聚糖通常以高分子形式溶于水，造成溶液黏度較高，給工業生產帶來諸多問題[2]。例如，在啤酒行業中，大麥作為主要生產原料，其β-葡聚糖含量（4%～8%）較高，造成麥汁和啤酒黏度增加，致使麥汁過濾困難、得率降低，并引起啤酒的非生物性渾濁，影響啤酒的穩定性和質量[3]。在飼料行業中，以大麥等谷物作為飼料，高分子質量的β-葡聚糖引起畜禽胃液黏度增加，阻礙單胃動物對養分的吸收，谷物飼用價值降低。β-1,3-1,4-葡聚糖酶（EC 3.1.2.73）是啤酒行業和飼料工業中一種重要工業酶制劑，它主要水解β-葡聚糖中β-1,4糖苷鍵連接的3-O-替代的葡萄糖殘基成為較小的聚合物，從而降低β-葡聚糖對啤酒和飼料行業所造成的問題[3-5]。

β-1,3-1,4-葡聚糖酶的獲得主要由微生物發酵生產，發酵方法主要有液體發酵[6-9]。相比于液體發酵而言，固體發酵具有生產成本低，工藝簡單，對機械設備和耗能等要求不高，環境污染小，適宜真菌生長等優勢，近年來越來越受到關注[10]。國內外關于真菌產β-1,3-1,4-葡聚糖酶的研究還不是很多，到目前為止主要以中溫菌木霉（Trichoderma）和黑曲霉（Aspergillus niger）為主[11]，而關于耐熱真菌發酵產β-1,3-1,4-葡聚糖酶的固體發酵的研究報道較少[12-13]。

本研究前期分離篩選得到一株擬青霉WPG-1，發現該菌能夠產β-1,3-1,4-葡聚糖酶，擬進一步采用固體發酵的方式，通過單因素試驗優化擬青霉WPG-1固體發酵產β-1,3-1,4-葡聚糖酶的發酵工藝，為其工業化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 培養基

菌種的初篩和復篩以及菌種保藏培養基都采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL。

種子液培養基：在250 mL三角瓶中加入1 g麩皮和50 mL營養鹽溶液，121 ℃滅菌30 min，冷卻后接種1 cm2大小左右菌絲體，置于空氣浴振蕩搖床中50 ℃、200 r/min振蕩培養24 h。

固態發酵培養基：碳源，氮源（氮素含量均為0.2%），20 mL營養鹽溶液（CaCl20.3 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，KH2PO45 g/L），調節pH值為5.0。

1.1.2 試劑

大麥葡聚糖、葡萄糖：美國Sigma公司；蛋白質低分子質量標準品、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）：大連TaKaRa公司；酵母提取物、胰蛋白胨：英國Oxoid公司；3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）：美國Amresco公司；TaqPlus DNA聚合酶、PCR引物：上海生工生物工程股份有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

LRH-恒溫恒濕培養箱：廣東省醫療器械廠；TU-1800PC紫外分光光度計：北京普析通用儀器設備有限責任公司；Power Pac Basic TM 型電泳儀：美國BIO-RAD 公司；GL-20B高速冷凍離心機：上海安亭科技儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種的篩選

將來自新疆、青海、西藏、寧夏等地的200多個土樣分批用無菌水稀釋100倍，吸取0.1 mL涂布于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基平板上，然后將平板置于45 ℃培養箱中靜置培養4 d，觀察平板菌落生長情況，挑選平板上不同的耐熱真菌劃線純化。將初篩出的菌株進行進一步劃線分離，再在PDA培養基上培養，直至得到單一菌株；再將得到的單一菌株在PDA培養基上保存于4 ℃條件下，每隔4～5周轉接一次。

1.3.2 菌種的鑒定

菌種鑒定分為兩個步驟：（1）肉眼觀察其單一菌落形態、顏色、氣味等；（2）采用分子生物學鑒定：DNA的提取與擴增：DNA的提取方法參照WANG L等的方法[14]。18S rDNA的擴增采用通用的引物NS1-NS24[15]。

聚合酶鏈反應（polymerse chin rection，PCR）體系：在50 μL的混合液中進行，混合液中含有2.3 μL 基因組DNA，5 μL PCR緩沖液，1 μL dNTP（1 mmol/L），2 μL引物（10 pmol/μL），0.7 μLTaq聚合酶（2 U/μL）和37 μL超純無菌水。

PCR條件：94 ℃4 min；94 ℃1 min，55 ℃1 min，72 ℃1.5 min，35個循環；最后延伸7 min。

DNA序列測定、序列比對和種系發育分析：PCR的擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳純化后，由上海Genecore生物技術有限公司進行測序通過Clustal X進行序列比對。對比對結果進行了校正和調整。選擇毛緣毛杯菌（Cookeina tricholoma）作為外群。用PAUP 4.0b10進行DNA分析。最后通過Bootstrap分析的1 000次重復和TBR交換技術對發育樹分支進行了驗證。

1.3.3 固體發酵產β-1,3-1,4-葡聚糖酶

在250 mL三角瓶中加入烘干后的各種碳源和19 mL營養鹽溶液，攪拌均勻，121 ℃滅菌30 min，冷卻后接種1 mL種子液，混勻后置于45 ℃培養箱中靜止培養4 d。

粗酶液的提取：每克固體發酵物加入10 mL 50 mmol/L，pH 6.0檸檬酸緩沖液，37 ℃下200 r/min振蕩提取2 h，10 000×g冷凍離心10 min，吸取上清液即為β-1,3-1,4-葡聚糖酶的粗酶液。

1.3.4 固體發酵產酶條件的優化

采用單因素試驗法優化擬青霉WPG-1固體發酵產β-1,3-1,4-葡聚糖酶的條件。選用不同的碳源考察對該菌株產酶的影響。在優化碳源基礎上通過改變水分含量（從60%～90%）、氮源種類（氮素含量均為0.2%）、培養基初始pH值和培養溫度。在最佳培養基和培養條件下，每天取樣后測β-1,3-1,4-葡聚糖酶活性和蛋白含量，了解產酶歷程。

1.3.5 酶活力及蛋白含量的測定

酶活力的測定方法[12]：取0.1 mL適當稀釋的酶液，加入0.9 mL（用50 mmol/L pH 6.0檸檬酸緩沖液配制）0.5%大麥葡聚糖底物中，60 ℃反應10 min，以葡萄糖作為標準采用DNS法測定所產生的還原糖量。β-1,3-1,4-葡聚糖酶的活力單位定義為：在上述反應條件下，每分鐘生成1 μmol葡萄糖所需要的酶量（U/g）。

蛋白含量的測定參照LOWRY O H等[17]的方法，以牛血清白蛋白作為標準蛋白。

1.3.6 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳及酶譜

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）電泳檢測按照LAEMMLI U K等[18]的方法。考馬斯亮藍R-250染色。β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶譜分析為正常的SDS-PAGE后（電泳膠中含有0.2%的大麥葡聚糖），將電泳膠取出用25%的異丙醇溶液浸泡3次（10 min/次），使蛋白復性，然后用緩沖液浸泡3次（10 min/次）洗去異丙醇溶液，最后將電泳膠置于45 ℃條件下保溫30 min，加入0.5 g/L的剛果紅溶液染色30 min，用1 mol/L NaCl溶液脫色直至顯現透明帶。

1.3.7 數據處理

每組試驗設置3個重復，試驗數據采用Excel軟件處理。

2 結果與分析

2.1 產酶菌株篩選

利用PDA培養基篩選平板，共篩選得到產葡聚糖酶真菌菌株25株，經搖瓶發酵（1 g麩皮，1 g蛋白胨和50 mL營養鹽溶液，接種1 cm2大小左右菌絲體，置于空氣浴振蕩搖床中50 ℃、200 r/min振蕩培養4 d）和酶活力測定，篩選出一株真菌產葡聚糖酶較高，為79.61 U/mL，該菌株在30～55 ℃范圍內生長良好，最適生長溫度45 ℃，當溫度＞55 ℃基本不生長。PDA培養基45 ℃培養5 d的單菌落結果見圖1。由圖1可知，菌落正面顏色呈灰粉色，從毛狀菌落，無特殊氣味；顯微鏡下孢子呈卵圓形，分生孢子梗類似掃帚分枝。

圖1 菌株WPG-1菌落形態特征Fig.1 Colony morphology of strain WPG-1

2.2 菌株的分子生物學鑒定

以提取的WPG-1菌株DNA作為模板，以通用PCR引物進行擴增，引物序列為SR1R：5-TACCTGGTTGATCCT GCCAGT-3；SR6R：5-CCTTGTTACGACTTTTACTT-3。PCR產物進行瓊脂糖電泳分析，結果見圖2。

圖2 菌株WPG-1的18S rDNA PCR擴增電泳圖Fig.2 Electrophresis of PCR amplified 18S rDNA of strain WPG-1

將圖2中第1泳道的PCR擴增產物進行測序后，全長為1 711 bp。在18S rDNA基因序列同源性基礎上構建系統發育樹，結果見圖3，結合形態學觀察，通過分子生物學提取DNA測序比對后，初步鑒定該菌株為擬青霉屬（Paecilomycessp.），菌株命名為WPG-1。

圖3 菌株WPG-1的18S rDNA序列系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain WPG-1 based on 18S rDNA sequences

2.3 不同碳源對菌株WPG-1固體發酵產β-1,3-1,4-葡聚糖酶的影響

分別采用燕麥粉、大麥粉、玉米芯、白酒酒糟、高粱稈、麩皮、稻草粉作為單一碳源進行固體發酵產酶試驗，結果如表1所示。

表1 不同碳源對擬青霉WPG-1產酶的影響Table 1 Effect of carbon sources on β-1,3-1,4-glucanase production by Paecilomyces sp.WPG-1

由表1可知，燕麥粉作為碳源時菌株WPG-1產酶量最高為589.64 U/g，麩皮次之（518.02 U/g），其他幾種碳源如玉米稈、高粱桿、稻草等用作碳源時，所產β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力均較低。這可能是由于燕麥粉中含有一定量的β-葡聚糖，而β-1,3-1,4-葡聚糖酶是誘導酶，可充分利用燕麥粉作為唯一碳源充分發酵產酶。因此，選擇燕麥粉作為固體發酵最佳碳源。

2.4 初始水分含量對菌株WPG-1固體發酵產β-1,3-1,4-葡聚糖酶的影響

固體發酵過程中，培養基初始水分含量是關鍵性因素之一。不同含水量對產β-1,3-1,4-葡聚糖酶的影響如圖4所示。由圖4可知，當培養基的初始水分含量為70%時，β-1,3-1,4-葡聚糖酶的產量最高（723.31 U/g）。許多研究表明固體發酵條件下，初始水分含量高適合大多數真菌生長和產酶[19]。這可能是因為含水量過低時，孢子萌發遲滯期延長，影響菌絲體的生長周期，同時降低了固態底物中營養物質的溶解性和微生物生長所需要的水分活度，從而導致產酶量較低，而當含水量過高時，培養及表面黏連，造成培養基溶氧量不足，而發酵不徹底[20]。因此調節適當的初始水分含量對菌株生長至關重要，該試驗選擇70%的初始水分含量固體發酵結果最適合。

圖4 初始水分含量對擬青霉WPG-1產β-1,3-1,4-葡聚糖酶的影響Fig.4 Effect of initial moisture content on β-1,3-1,4-glucanase productionby Paecilomyces sp.WPG-1

2.5 不同氮源對菌株WPG-1固體發酵產β-1,3-1,4-葡聚糖酶的影響

β-1,3-1,4-葡聚糖酶屬于誘導酶，其產酶量的高低受到酶誘導物及酶蛋白質前體的調控，而酶蛋白質的前體主要來自氮源。因此氮源的類型及性質都會影響酶的合成和分泌。不同氮源（氮素含量均為0.2%）對產酶的影響結果如表2所示。

表2 不同氮源對擬青霉WPG-1產酶的影響Table 2 Effect of nitrogen sources on β-1,3-1,4-glucanase production by Paecilomyces sp.WPG-1

由表2可知，國產蛋白胨作為氮源時，產β-1,3-1,4-葡聚糖酶活最高為1 167.56 U/g。因此，選擇國產蛋白胨作為最佳氮源，進行下一步實驗優化。

2.6 培養基初始pH對菌株WPG-1固體發酵產β-1,3-1,4-葡聚糖酶的影響

圖5 初始pH值對擬青霉WPG-1固體發酵產β-1,3-1,4-葡聚糖酶的影響Fig.5 Effect of initial pH on β-1,3-1,4-glucanase production by Paecilomyces sp.WPG-1

由圖5可知，偏酸性環境下有利于β-1,3-1,4-葡聚糖酶的合成。當初始pH自然（pH 5.4）時，擬青霉WPG-1固體發酵產β-1,3-1,4-葡聚糖酶的量達到最大（1 187.30 U/g）。這與李孝輝等[16]報道的黑曲霉G-415菌株固體發酵產β-葡聚糖酶的情況一致。因此，選擇當營養鹽初始pH為自然時為最佳發酵pH。

2.7 培養溫度對菌株WPG-1固體發酵產β-1,3-1,4-葡聚糖酶的影響

圖6 培養溫度對擬青霉WPG-1固體發酵產β-1,3-1,4-葡聚糖酶的影響Fig.6 Effect of culture temperature on β-1,3-1,4-glucanase production by Paecilomyces sp.WPG-1

由圖6可知，當發酵溫度為45 ℃時菌株產酶量最高，達到1 204.11 U/g。當培養溫度繼續上升至55 ℃時，酶活力急劇下降，為最高酶活力的30%左右。這是因為該菌株最適生長溫度為45 ℃，當溫度超過或低于45 ℃時，菌株都不能很好的生長，那么不能很好的利用培養基中的營養物質進行發酵產酶，因此導致產酶量下降。本實驗選擇發酵溫度為45 ℃為最佳固體發酵溫度。

2.8 菌株WPG-1固體發酵產β-1,3-1,4-葡聚糖酶的產酶歷程

確定各發酵條件的最優參數后，在最佳發酵條件的基礎上考察β-1,3-1,4-葡聚糖酶的產酶歷程，結果如圖7所示，所產胞外蛋白的SDS-PAGE電泳圖及相應的酶譜圖如圖8所示。

圖7 擬青霉WPG-1固體發酵產β-1,3-1,4-葡聚糖酶的歷程Fig.7 The time course of β-1,3-1,4-glucanase production by Paecilomyces sp.WPG-1

由圖7可知，菌株擬青霉WPG-1在優化后的發酵條件下，從第3天開始產酶速度加快，到第5天時酶活力達到最高值1 324.49 U/g，然后隨著發酵時間的增加，酶活力開始下降。因此，發酵時間5 d為宜。

圖8 不同發酵時間擬青霉WPG-1發酵液SDS-PAGE電泳圖及酶譜圖Fig.8 SDS-PAGE electrophoresis and enzyme spectrum diagram of the fermentation broth produced by Paecilomyces sp.WPG-1 with different time

由圖8可知，擬青霉WPG-1所產胞外蛋白僅有1條β-1,3-1,4-葡聚糖酶帶，分子質量為35 ku左右。

3 結論

從全國來源不同的土樣中篩選得到一株產β-1,3-1,4-葡聚糖酶的真菌菌株，經過菌落形態及分子生物學檢測，初步鑒定為擬青霉（Paecilomycessp.）WPG-1。該菌株的最適生長溫度為45 ℃，通過單因素優化試驗結果表明，當以燕麥粉為碳源，蛋白胨（氮素含量0.2%）為氮源，初始水分含量70%，初始pH為自然，培養溫度45 ℃時，培養發酵5 d，擬青霉WPG-1固體發酵產β-1,3-1,4-葡聚糖1 324.49 U/g，可較好地運用于飼料及啤酒工業。

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