黃芪甲苷對關節不穩誘導型小鼠膝骨關節炎的保護作用*

趙永見，薛純純，王利波，李曉鋒，施 杞，王擁軍，舒 冰△

(1.上海中醫藥大學附屬龍華醫院，上海 200032;2.上海中醫藥大學脊柱病研究所，上海 200032)

黃芪甲苷對關節不穩誘導型小鼠膝骨關節炎的保護作用*

趙永見1，2，薛純純1，2，王利波1，2，李曉鋒1，2，施 杞1，2，王擁軍1，2，舒 冰1，2△

(1.上海中醫藥大學附屬龍華醫院，上海 200032;2.上海中醫藥大學脊柱病研究所，上海 200032)

目的:觀察黃芪甲苷能否緩解膝骨關節炎的病理改變。方法:將小鼠按隨機數字表法分為假手術組、模型組和黃芪甲苷組，實驗組通過關節不穩術造成小鼠膝骨關節炎模型，并分別給予生理鹽水和黃芪甲苷腹腔注射8周。取左側膝關節進行三維重建和組織學染色。結果:模型組小鼠膝關節半月板鈣化明顯增加，關節軟骨變薄，II型膠原明顯減少，破壞明顯，邊緣骨贅形成;黃芪甲苷組均有明顯改善。結論:黃芪甲苷可以減輕關節不穩誘導的小鼠膝骨關節炎病理改變。

膝骨關節炎;黃芪甲苷;軟骨退變

膝骨關節炎是一種常見的慢性退行性疾病，臨床上表現為關節疼痛、關節活動受限甚至關節功能喪失、病理改變以進行性膝關節軟骨丟失、關節緣骨贅生成、滑膜炎癥和增生、半月板鈣化為特點［1］。由于該病發病率高、遷延難愈，嚴重影響到患者的生活質量［2］。

半月板是位于膝關節股骨和脛骨關節表面之間的半環形纖維軟骨結構，其主要生理功能是在膝關節運動或者靜態受壓時緩沖并分散壓力，具有維持膝關節穩定性和潤滑關節的作用。前交叉韌帶起于股骨外髁的內側面，止于脛骨髁間嵴之間，是維持膝關節穩定性的重要結構。臨床上半月板和前交叉韌帶損傷可導致關節失穩、壓力緩沖失常、關節表面受壓增大且分布不均，關節軟骨功能異常發生退變。因此，通過給小鼠膝關節進行內側半月板聯合前交叉韌帶離斷術，可以模擬膝關節不穩，誘導骨關節炎的發生［3］。

施杞教授總結出氣血不足為本病發病之本，氣滯血瘀為病機之關鍵，提出“益氣化瘀、標本兼顧”的治療法則。黃芪為補氣圣藥，臨床常重用黃芪治療此類疾病，療效顯著。黃芪甲苷是黃芪的主要有效組分之一，研究發現其具有抗炎、調節免疫的藥理學作用［4］。我們通過給予小鼠膝關節進行內側半月板聯合前交叉韌帶離斷術，模擬膝關節不穩，誘導膝骨關節炎的發生，體內驗證黃芪甲苷是否對關節不穩誘導的膝骨關節炎具有保護作用。

1 材料與方法

1.1 小鼠膝骨關節炎模型制備

12周齡雄性野生型C57/B6小鼠20只分為模型組與黃芪甲苷組，每組10只。將小鼠以氯胺胴(0.5 mg/10 g體質量)腹腔注射麻醉，左膝關節內側備皮，碘伏消毒，以膝關節脛骨平臺水平為中心，沿脛骨內側做2 cm縱形切口，離斷內側副韌帶，沿脛骨平臺打開膝關節腔。仔細游離出內側半月板，從中間離斷，并進一步離斷前交叉韌帶，關閉關節腔，縫合筋膜和皮膚［5］。取10只雄性野生型C57/B6小鼠作為假手術對照組，左側膝關節內側做皮膚切開并縫合。術后小鼠自由活動，常規飲食飼養。

1.2 藥物干預

術后第2天起，將黃芪甲苷與玉米油溶解后配成10 m g/ml，實驗組小鼠按每只每次0.1ml/10 g/d腹腔注射8周。黃芪甲苷標準品(CAS:83207-58-3)購自上海藥檢所上海東方藥品科技實業有限公司。模型組和假手術組分別給予等體積玉米油腹腔注射。

1.3 取材與標本處理

藥物干預8周后，將小鼠以氯胺酮麻醉處死，取出左側膝關節，剔除周圍肌肉結締組織，在10% NBF(VWR)中固定2 d，去離子水沖洗。

1.4 Micro-CT掃描及三維重建分析

用SCANCO Micro-CT80對固定好的小鼠膝關節進行掃描，電壓55 kV，電流72 uA，以10 um的斷層厚度掃描500個層面。以300 ms積分時間進行2D重建，以230～1000閾值范圍進行3D重建。

1.5 組織形態學觀察

將固定后的膝關節以蟻酸脫鈣液脫鈣9 d，梯度酒精常規脫水，二甲苯透明后石蠟包埋。于脛骨平臺內側處切取4 μm厚失狀位連續切片。切片烤片后分別經二甲苯中脫蠟，梯度乙醇脫蠟至水后進行阿爾辛蘭/橙黃G染色。切片分別經過1%鹽酸/乙醇30 s，1%阿爾辛蘭/蘇木素30 min，1%鹽酸/乙醇2 s，0.5%氨水15 s，95%乙醇1 min，橙黃G/伊紅染液(0.5%橙黃+2%伊紅)1.5 min。再經過梯度乙醇脫水、二甲苯透明后封片，光學顯微鏡下觀察分析膝關節病理改變。

1.6 免疫組織化學染色方法

切片經過二甲苯和梯度酒精常規脫蠟至水，4%中性多聚甲醛固定15 min，PBS沖洗后，3%過氧化氫(H2O2)浸泡10 min去除內源性過氧化物酶，PBS沖洗，以10 mg/ml蛋白酶K常溫消化10 min以進行抗原修復。5%山羊血清封閉30 min，以兔抗II型膠原抗體(Abcam，ab34712)4℃孵育過夜，陰性對照用PBS代替I抗。PBS反復沖洗后，1∶200山羊抗兔二抗室溫孵育30 min，PBS沖洗后滴加抗生蛋白鏈菌素-辣根過氧化物酶孵育30 min，PBS沖洗，DAB顯色劑顯色3 min，清水沖凈，蘇木素復染后鹽酸酒精分化、氨水返藍，常規梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。棕色染色為陽性表達，無著色為陰性。

2 結果

2.1 膝關節三維重建

假手術組膝關節脛骨平臺內側光滑平整，內側半月板處可見形狀規則的楔形鈣化組織。術后8周，模型組膝關節脛骨平臺內側邊緣骨贅生成，內側半月板處骨組織明顯增大，且形狀不規則。黃芪甲苷組脛骨平臺內側邊緣稍有骨贅生成和，內側半月板骨組織增大較模型組減輕(圖1)。

2.2 膝關節組織病理學改變

阿爾辛蘭/橙黃G染色淡藍色示軟骨組織，橙黃色示骨組織。假手術組膝關節軟骨深層染色較深，淺層染色稍淺，關節軟骨表面光滑平整，細胞排列整齊。半月板形態規則外周為軟骨組織，內部可見少量鈣化骨組織。術后8周，模型組膝關節軟骨表面破損，軟骨層明顯變薄，軟骨細胞排列紊亂，關節軟骨邊緣骨贅形成，半月板及內部鈣化組織均明顯增大，且形態不規則。黃芪甲苷組膝關節軟骨表面稍有不平，軟骨層輕微變薄，表層染色減少，軟骨邊緣骨贅形成有限，內側半月板及內部鈣化組織稍有增大(圖2)。

2.3 膝關節軟骨II型膠原表達

免疫組化顯示，假手術組膝關節軟骨深層II型膠原染色豐富，表層染色稍淺，分布均勻。模型組膝關節軟骨II型膠原染色明顯變薄，以表層丟失為主。黃芪甲苷組膝關節軟骨II型膠原染色稍有減少，但仍具有表層淺染、深層深染、染色連續性的特點，表層染色稍有不均勻(圖3)。表明模型組膝關節軟骨基質中的II型膠原顯著降低，黃芪甲苷組膝關節軟骨基質中的II型膠原在表達水平和分布方式上均有改善。

圖1 膝關節三維重建圖

3 討論

圖2 膝關節阿爾辛蘭/橙黃G染色

圖3 膝關節II型膠原免疫組化染色

II型膠原是彈性軟骨的主要細胞外基質，對于緩沖壓力有著重要作用，同時它也是軟骨細胞特有的分子標志［5］。在生理條件下，關節軟骨維持著軟骨特征，不向肥大軟骨細胞分化，但在骨關節炎的關節軟骨中，細胞外基質中的II型膠原和蛋白多糖降解，軟骨細胞的特性發生變化，不能維持軟骨組織的特征。

本研究通過離斷小鼠膝關節內側半月板和前交叉韌帶，模擬膝關節不穩狀態，誘導膝骨關節炎。膝關節的三維重建和組織學染色顯示出典型的骨關節炎表現，包括關節表面破壞，軟骨層變薄，軟骨邊緣骨贅生成，半月板鈣化，II型膠原表達降低。

黃芪甲苷是黃芪的重要生理活性成分，常作為黃芪藥材的定性定量指標。黃芪甲苷的主要藥理作用包括抗炎抗病毒、免疫調節作用［6］，抗氧化、缺氧及缺氧/復氧損傷［7-8］引起的細胞損傷。針對骨關節炎研究發現，黃芪甲苷對佐劑型大鼠膝骨關節炎有一定的保護作用［9］，其機制可能與抑制炎癥因子白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子(TNFα)的表達［10-11］，進而抑制軟骨細胞凋亡和細胞外基質降解有關［12-13］。據此我們推測，黃芪甲苷可能通過抑制軟骨細胞炎癥反應，抑制細胞外基質降解，并促進軟骨細胞增殖及合成細胞外基質，部分緩解關節不穩誘導的膝骨關節炎的發生。

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Protective Effect of the Astragalus IV on the Knee Osteoarthritis Induced by Joint Instability in Mice

ZHAO Yong-jian1，2，XUE Chun-chun1，2，WANG Li-bo1，2，LI Xiao-feng1，2，SHI Qi1，2，WANG Yong-jun1，2，SHU Bing1，2
(1.Longhua Hospital，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200032，China; 2.Spine Research Institute，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200032，China)

Objective:to observe the effect of Astragaloside on the pathological changes of knee osteoarthritis.Methods:mice were randomly divided into sham group，model group and Astragaloside IV group.Mice in model group and Astragaloside IV group were performed surgery in left knee joints to induce knee osteoarthritis，and were treated with saline and Astragaloside IV respectively.After 8 week-treatment，the left knee joints were harvested for Micro-CT scanning and reconstruction and pathological observation.Results:obvious meniscus ossification，thinner articular cartilage with cracks and decreased Type II collagen staining，and osteophyte at the edge of articular cartilage were developed in the left knee joints of model group.Changes of articular cartilage and meniscus in Astragaloside IV were clearly better than model group.Conclusion:Astragaloside IV could alleviate articular cartilage degeneration in knee osteoarthritis mice model.

knee osteoarthritis;Astragaloside IV;cartilage degeneration

R684.3

B

1006-3250(2015)06-0668-03

2015-01-06

上海市自然科學基金青年項目(12ZR1450400)-BMP2在軟骨細胞退變中的作用及益氣化瘀中藥調節BMP/Smad信號通路抑制軟骨細胞退變的研究;上海高校青年教師培養資助計劃(ZZSZY12064)-黃芪甲苷調節BMP/Smad信號通路抑制軟骨細胞退變的研究;國家自然科學基金青年基金(81403239)-腎性骨病方調節BMP/Smad信號通路防治腎性骨病的研究;國家教育部“創新團隊”發展計劃(IRT1270)-中醫“腎主骨”理論的應用基礎研究;上海中醫藥大學“085工程”中醫藥學一流學科建設項目(085ZY1204)-中醫“腎藏精”及“腎主骨”理論的臨床與基礎研究;上海高校實驗技術隊伍建設計劃(LH01.24.001)

趙永見(1983-)，男，山東臨沂人，檢驗師，醫學學士，從事中醫藥防治骨與軟骨退行性病變的臨床與研究。

△通訊作者:舒 冰，女，助理研究員，E-mail:shubing523@ hotmail.com。