微透析技術在骨科的應用

張朕，王丹，朱澤興，張樹明，喬林

1.同濟大學 附屬楊浦醫院，上海 200090；2.第二炮兵總醫院a.藥劑科；b.骨科；北京 100088

微透析技術（microdialysis，MD）作為一種成熟、可靠的技術，依賴其自身優勢，經過半個世紀的發展，已在臨床前實驗、藥物開發、臨床監測等領域得到廣泛發展和應用。目前，FDA和CE已批準其應用于人類心肌、腦組織、肺和一些腫瘤的研究[1]。

MD 的快速發展與其先天的一些優勢不可分割。單根微透析探針植入所造成的創傷僅相當于留置針，加上其多點取樣、連續監測、極少量的體液丟失等優勢，可配合多種檢測設備實時監測使用，取得目標物純度高，使人類的體內組織化學測定成為可能，而且在任何器官中都可行。經過近50 年的發展，目前MD 相關文獻近20 萬篇，廣泛涉及心、腦、肺、肝、膽、腎、眼、耳、骨、肌肉、血液、皮膚、胚胎、前列腺等組織[1]。

同樣，MD 在骨科也得到了非常廣泛的應用。1996 年，Thorsen 把MD 應用于脛骨干骺端骨組織代謝檢測。2003 年，Stolle 開創性地在骨皮質中利用MD探針檢測抗菌藥物局部濃度，次年他又將應用范圍擴大到松質骨，與傳統方法對比后，證實MD 在骨組織中的應用是可行的。2007年B?geh?j撰文，正式把其作為一種研究方法進行系統的歸納總結[2]。微透析探針還可以作為局部用藥的途徑，應用于實驗中[3-6]。在此，我們就MD 在骨科的應用做簡要總結，希望對大家有所幫助。

1 骨科基礎方面

MD技術在局部取樣方面有獨特的優勢，特別是在局部代謝產物和藥物濃度方面，但將MD 引入骨科基礎進行廣泛的研究則相對較晚，Thorsen 等在1996 年研究應力刺激下人骨組織前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）釋放時首次把該技術引入基礎研究，他們把MD 探針置于脛骨干骺端骨質較為疏松的部位，發現在應力刺激下，人脛骨近端的PGE2增長了2.5～3.5 倍，證實PGE2 與動態機械運動有明確關系。Korth 等在研究外科止血帶對骨骼肌能量代謝的影響時，通過MD 配合高效液相色譜，發現在使用止血帶30 min 后，目標肢體的葡萄糖水平下降了40%，而乳酸和次黃嘌呤的水平則上升了200%以上，膽堿水平也有大幅增加，而再灌注后葡萄糖的水平可以快速回升，但乳酸和次黃嘌呤的水平卻持續增加，證實了松止血帶后并不能及時有效地緩解肢體缺血情況，該實驗結果認為缺血反而會加重[7]。Mikkelsen 利用MD 檢測非甾體抗炎藥（NSAID）的同時，把其也作為一種局部用藥的途徑，發現距離用藥點1 cm 遠處PGE2 的水平下降了85%，4 cm 處則下降了30%～50%，證明NSAID 類藥物可以有效抑制PGE2分泌，在活體身上解釋了NSAID類藥物的作用機理[6]。隨后，Britt 和Mackey 等分別進一步證實了這一結論，并認為運動誘導的自適應性（exercise-induced adaptive increase）同時被抑制了[8-9]。在研究運動對成骨的影響時，Keitaro 等利用MD 監測運動前后72 h 間志愿者骨堿性磷酸酶（bone-specific alkaline phosphatase，BAP）和1 型C 肽膠原蛋白（procollagen type 1 C-peptide，P1P）的水平，發現BAP水平無明顯變化，而P1P 在24 h 有明顯增高，標志著體內膠原纖維形成加強[10]。為了減小MD 應用于人體骨骼肌的誤差，Patrik針對該條件對相對回收率隨時間變化做出校正，經過4～6 個月的監測，得出了MD長時間應用在人骨骼肌中，其相對回收率是穩定的結論，并認為低強度的運動對其沒有影響，但會因具體項目和場合而異[11]。

2 慢性損傷方面

MD 在慢性損傷方面的應用主要集中于對肌筋膜疼痛綜合征（myofascial pain syndromes，MPS）的研究。2004 年，Lars 等研究斜方肌慢性疼痛（trapezius myalgia，TM）時發現，患者肌肉內5-羥色胺（5-HT）和谷氨酸水平與疼痛強度、壓痛閾值（pressure pain threshold，PPT）、無氧代謝密切相關。2005 年，Shah 利用MD 在活體研究MPS 評價了該類患者骨骼肌的生化環境，發現其質子、緩激肽（bradykinin，BKN）、降鈣素基因相關肽、P 物質、腫瘤壞死因子α、白細胞介素（IL）1β、血清素和去甲腎上腺素的水平均高于正常人，而pH值卻顯著低于正常人。另一項研究中，又發現該類患者斜方肌間隙內的鉀離子水平相對于正常人恢復到正常水平的時間明顯延長，而白介素6 和乳酸脫氫酶的水平則保持正常。Gerdle 在2008 年發現2 種激肽類物質——BKN 和血管舒張素（kallidin，KAL）——也參與了痛覺過敏，他將TM 組和頸椎相關的疼痛分開觀察，并設對照組，發現在20 min的低強度運動和休息后，KAL和BKN 均明顯增高，KAL 最高見于頸椎組，而TM 組還是明顯高于對 照，TM 組 的BKN 則明顯高于其他2 組[12]。2011 年，Ghafouri 針對N-十六酰胺乙醇（N-palmitoylethanolamide，PEA）和N-硬脂酰乙醇胺（N-stearoylethanolamide，SEA）進行檢測，發現它們在TM 患者斜方肌中的濃度同樣明顯高于正常人[13]。Larsson和Sj?gaard 認同以上觀點，前者針對體力勞動8 h后的MPS 患者，而且發現肌電圖（EMG）結果、工作強度評定結果、精神緊張度似乎與這些代謝物質的變化沒有明顯關聯[14-15]。然而Gerd 似乎不全認同這些觀點，他在European Journal of Pain上撰文認為，針對斜方肌慢性疼痛的患者，在安靜休息4 h 后，結果示PGE2和谷氨酸的水平與正常人并無統計學差異。

3 創傷骨科方面

在骨創方面，Yvonne 把MD 運用到Wistar 大鼠股骨創傷后24 h 細胞因子和生長因子的監測中，測定其總蛋白、IL-6的濃度，其中總蛋白的含量是不斷下降的，5 h 后趨于平緩，而IL-6 在傷后即有明顯增長，12～15 h 達到高峰，傷后24 h 后則已低于130 pg/mL，作者還試圖檢測TGFβ1，但沒有成功，IL-6和TGF-β1為骨折愈合早期的標志性細胞因子，通過對其的檢測，讓我們在分子水平上對骨折愈合初期變化有進一步了解[16]。在研究不同等級的創傷后關節液代謝變化時，St?lman 引入了MD 來檢測滑囊膜的炎性物質，如葡萄糖、乳酸、PGE2 等，發現冷敷和局部加壓可以有效降低滑囊膜的炎性反應，PGE2的變化與溫度密切相關，低溫還可以有效降低乳酸水平[17]；同時還發現，注射酮咯酸類藥物對降低PGE2 的水平有明顯作用，而嗎啡在這方面沒有明顯反應[18]。機體對創傷的反應是一個大課題，但基于分子水平代謝的變化了解并不全面，”中間過程”是模糊的，而MD為我們提供了一種簡單可行的方法。

4 關節外科方面

St?lman 針對關節發表的一系列MD 應用文章中，對關節鏡手術后滑囊膜的物質代謝進行檢測，發現在關節鏡前交叉韌帶（ACL）重建術后，以簡單關節鏡術和對側大腿的脂肪組織為對照，ACL 組常規術前應用嗎啡，術后低溫和加壓處理，結果顯示關節鏡組滑囊膜乳酸、糖代謝水平術后相對于對照組明顯增高，相對于ACL 組無明顯差異，但PGE2 明顯低于ACL 組，作者認為ACL 重建術較關節鏡術并未增加炎癥反應[19]。而且關節鏡術后，滑囊膜的糖代謝和PGE2 水平均上升，同時疼痛感也明顯加重，他們認為這兩者呈正相關關系。H?gbergy 也得出了同樣的結論，并發現術后應用類鴉片類藥物可減輕葡萄糖和PGE2 的水平。他還研究了兒茶酚胺類物質對膝關節鏡術后滑囊膜的影響，并利用微透析探針局部用藥，發現實驗組乳酸均成倍增長，腎上腺素可有效降低葡萄糖和血流水平[4]。2010 年，Helmark 針對早期骨性關節炎（osteoarthritis，OA）做了一系列研究，他在超聲引導下，向關節內和滑膜臨近組織放置微透析探針，并在微透析灌流液中添加放射性標記葡萄糖，檢測幾種關節炎相關物質——軟骨寡聚基質蛋白（cartilage oligomeric matrix protein，COMP）、軟骨蛋白多糖核心蛋白（cartilage-specific proteoglycan core protein，CSPCP）和葡萄糖-半乳糖化吡啶啉（glucosyl-galactosyl-pyridinoline，Glc-Gal-PYD），結果顯示COMP 和Glc-Gal-PYD 在關節內明顯高于滑膜周圍組織，CSPCP未見明顯差異，他們認為利用MD對骨性關節炎進行檢測切實可靠，并有良好的應用前景[5]。在另一組實驗中，他們將31名OA 患者隨機分為運動組（NEx）和非運動組（Ex），在3 h 鍛煉后，發現Ex組關節內IL-10的水平明顯高于NEx組，而IL-6 和IL-8 在2 組中均增高，Ex 組的COMP 則明顯低于NEx組，證明軟骨保護類抗炎藥可能對OA患者是有益的[6]。目前對于股骨頭缺血性壞死的發病機制，有人認為不單單是因為股骨頭動脈血供較差引起，靜脈回流受阻造成骨內高壓也可能是一種機制。依據這一學說，B?geh?j 和Lorenzen 利用MD 對股骨頭的缺血進行研究。B?geh?j 在骨質上開直徑略大于MD 探針的洞，以便微透析探針置入檢測，完善MD 應用于監測股骨頭缺血的方法[2,20]；此后，他又配合體外實驗進行對比，發現由于在股骨開洞略大于微透析探針，期間會存在一個間隙，加上放置探針時的操作，會對實驗結果初期產生影響，但認為在一個平衡期后，實驗結果是真實、可靠的[21]。Lorenzen則在研究股骨頭表面置換術的手術入路時引進了MD，股骨頭表面置換術入路的選擇主要有后側入路和前外側入路2 種，但哪種入路對術后血液供應影響最小卻沒有客觀的依據。Lorenzen 在術中把MD探針直接放置在股骨頭的上象限，通過術后觀察發現，后入路較前外側入路缺血更為嚴重，而2 種入路在血流方面沒有區別[22]。

5 骨科感染方面

在治療糖尿病足方面，Traunmüller 用MD 評價糖肽類抗生素達托霉素對糖尿病足患者發炎的皮下脂肪和骨組織的滲透能力，認為每日1 次靜脈注射6 mg/kg體重的達托霉素，可在足皮下脂肪和跖骨達到有效濃度，可有效治療糖尿病足和骨髓炎[23]。他用相同方法對另一種唑烷酮類的抗生素利奈唑胺做了相關評價，認為每日2 次靜脈注射600 mg 可有效治療糖尿病足和骨髓炎[24]。隨后Schintler 對大劑量的磷霉素做了類似研究，靜脈注射100 mg/kg 體重的磷霉素，其在跖骨中可以達到有效濃度，同樣是治療糖尿病足感染的良藥[25]。2014年，T?ttrup利用MD分析頭孢類抗生素頭孢呋辛在豬皮質骨和松質骨的藥代動力學，在游離血漿、表皮、松質骨和皮質骨4組目標物中，5 h 后分別取得了6013±1339、3222±1086、2232±635 和952±290 μg/mL 的結果，分析發現頭孢呋辛在松質骨和皮質骨的代謝明顯不同，并認為骨組織對于頭孢呋辛可以認為是一種隔室[26]。在研究抗菌藥物方面，MD 是非常成熟的技術，也是一個非常好的工具。

6 顯微外科方面

MD應用于懷疑缺血的部位，可盡早判斷局部組織血供。早在1998 年，R?jdmark 就開創性地將MD應用于游離皮瓣的缺血監測，開啟了MD 在游離皮瓣研究中的應用，并成功地發現了血栓和血腫的發生。Udesen在對橫行下腹直肌肌皮瓣的監測中明確指出，當皮瓣發生缺血時，葡萄糖下降而乳酸丙酮酸水平是上升的，這種差別有統計學意義，而在再灌注結束后，這些變化均可恢復正常，在1 例因動脈血栓形成導致的失敗病例中發現，其中葡萄糖濃度低到不可檢測，乳酸濃度增高后因缺少葡萄糖而停止，丙酮酸的濃度在非常高的水平。作者從而得出結論：MD可以用于監測游離皮瓣早期缺血，使早期手術成為可能。2004 年，Set?l?在豬模型上系統、科學地證實了以上結論，并指出靜脈性缺血要比動脈性缺血乳酸水平更低，乳酸丙酮酸比值和乳酸葡萄糖比值更高，利用這些發現可以判斷缺血的性質[27]。同理，MD 還被應用于頜面部皮瓣[28]和腓骨游離皮瓣的監測[29]。在研究頜面部皮瓣時，由于其特殊性，面部自覺、不自覺的活動可能對皮瓣的預后包括疤痕大小造成影響，因此在整形手術中常用鎮靜劑，于是Silvia利用MD和氧分壓評價了右美托咪啶應用于游離肌皮瓣移植術后，發現右美托咪啶在再灌注和局部組織代謝上對肌皮瓣無不良影響，認為可以應用于頜面部游離皮瓣移植術后肌肉鎮靜[30]。

7 脊柱方面

目前，MD在神經外科從臨床前階段到臨床階段都得到廣泛應用，已有多篇相關綜述。同樣，在脊髓方面的研究也有大量文獻，大部分是關于神經疼痛代謝方面的。Brodin 利用MD 對貓脊髓后角釋放P物質進行研究，將MD 引入脊髓研究方面[31]。Parrot提出把毛細管電泳分離-激光誘導熒光檢測（CELIFD）與MD 配合，檢測人脊髓后角的γ-氨基丁酸、丙氨酸、左旋天門冬氨酸在圍手術期的變化，認為該檢測方法準確且高效，較其他方法有獨特優勢[32]。MD還可用于檢測神經鞘內天門冬氨酸、谷氨酸或一氧化氮，Hsieh發現其中的酮咯酸類藥物可以在脊髓損傷后引發這2 種物質的濃度升高，對小鼠脊髓干缺血起到保護作用[33]。MD 探針還可置入脊髓，檢測其細胞外液目標物質的水平，Tsai 通過檢測小鼠脊髓損傷前后細胞外液維生素C 的濃度來評價脊髓損傷，發現損傷后小鼠脊髓細胞外液中維生素C 的濃度是逐漸增高的[34]。他噴他多是一種通過激動μ型阿片受體和抑制去甲腎上腺素再攝取的鎮痛藥，在研究其對脊髓性疼痛的作用效果時，Thomas 將MD探針置入小鼠脊髓，檢測到他噴他多提升了脊髓內去甲腎上腺素的水平而對5-HT沒有明顯影響，成功地抑制去甲腎上腺素再攝取[35]。Okon在研究急性脊髓挫傷與擠壓傷后不同代謝產物的反應時，把MD探針與脊髓成30°角深7 mm 置于豬脊髓T9、T10 水平，發現挫傷后乳酸和丙酮酸的水平在近中心的部位均上升，葡萄糖則保持穩定，在持續給予擠壓后，乳酸水平有短暫上升，葡萄糖和丙酮酸水平快速下降，認為這一現象可能與脊髓干血運受阻有關[36]。

8 骨腫瘤方面

Ekstr?m 對大劑量甲氨蝶呤治療股骨惡性纖維組織瘤采用連續瘤內微透析技術，認為這是一種研究癌癥藥物治療局部藥物暴露與療效關系的非常有用的方法。Thompson 對馬法蘭ILI（isolated limb infusion）治療肢體惡性腫瘤進行研究，發現馬法蘭峰值和濃度在血漿中明顯高于皮下和瘤內，認為腫瘤對馬法蘭并沒有優先攝取，而腫瘤的反應與馬法蘭的濃度有直接關系，他們認為MD 非常適合ILI 用藥的檢測[37]。Brunner 總結了MD 在腫瘤方面的應用，并與影像學方法和傳統方法做了對比，認為MD 在化療藥物的開發中同樣具有廣泛前景[38]。

MD作為一項技術已走過半個世紀，在很多方面得到廣泛應用，但其臨床應用更多是在神經外科方面，而且已經非常成熟。以上我們總結了MD 在骨科方面的應用。MD 的一些先天優勢，如微創、定位取樣、多點監測、連續取樣、多種檢測手段，可以讓我們更深入地了解”中間過程”，通過MD 進行分子水平的檢測，在骨科仍具有眾多應用前景。

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